陳 娟 馬曉曄

視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)是一種眼科常見的遺傳性疾病。患者早期表現(xiàn)為“夜盲”，進(jìn)而表現(xiàn)為周邊視野缺損，最終導(dǎo)致中心視力喪失。該病目前尚無有效的預(yù)防和治愈方法。近年來，隨著基因治療、視網(wǎng)膜移植等技術(shù)在動物實驗中的廣泛開展，給人類RP的治療帶來了新的希望。本文就當(dāng)前RP的各種最新治療進(jìn)展綜述如下。

1 基因治療

1.1 RP基因 RP具有多種遺傳方式，其中常染色體顯性遺傳RP(autosomal dominant retinitis pigmentosa，ADRP)占15% ～20%，常染色體隱性遺傳RP(autosomal recessive retinitis pigmentosa，ARRP)占20% ～25%，X染色體連鎖遺傳 RP(X-linked retinitis pigmentosa，XLRP)占10% ～15%，散發(fā)型 RP占40% ～45%［1］。目前已有超過60種ADRP基因、20種ARRP基因及5種XLRP基因被定位;其中引起ADRP的視紫紅質(zhì)基因的突變位點超過150個［2］。與隱性RP相關(guān)的位點有20個，其中14個基因被克隆，多數(shù)基因較為少見。XLRP患者無論從發(fā)病時間還是預(yù)后角度講均最為嚴(yán)重，已知有5個位點與XLRP有關(guān)，其中有2個基因已被克隆，這2個基因的蛋白產(chǎn)物在多種組織中表達(dá)，但蛋白質(zhì)的確切功能還不清楚。不斷發(fā)現(xiàn)的與RP相關(guān)的基因和位點以及基因突變位點的差異表明，導(dǎo)致RP的分子發(fā)病機制非常復(fù)雜?；虻膹V泛深入研究為基因治療提供了堅實的基礎(chǔ)。

1.2 基因治療途徑 主要分體內(nèi)和體外兩種。體內(nèi)基因治療主要用合適的載體攜帶目的基因經(jīng)視網(wǎng)膜下腔注射或玻璃體腔注射進(jìn)行治療。所用的載體主要分為病毒載體和非病毒載體。體外基因治療主要是把轉(zhuǎn)基因靶細(xì)胞移植到眼內(nèi)，使外源性基因表達(dá)與視網(wǎng)膜移植手術(shù)聯(lián)合使用以達(dá)到基因治療的目的。

1.3 基因增補 ARRP主要是由于基因突變、基因產(chǎn)物缺乏引起的。對于這種類型的RP，可以通過基因增補技術(shù)把正?；?qū)敫泄饧?xì)胞內(nèi)，以產(chǎn)生正常的基因表型，達(dá)到治療的目的。RPE65基因特別表達(dá)于視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)，并且在11-順-視黃醛、視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞視蛋白色基的再循環(huán)中起著重要作用。Mao等［3］將野生型人RHO基因?qū)隦HO-/-小鼠后，視網(wǎng)膜電圖表明接受基因治療的小鼠在治療后6個月，A波振幅增加了79%，治療眼外核層厚度與對照眼相比增加了80%。這些結(jié)果表明，野生型RHO基因具有抑制突變蛋白的功能。Acland等［4］將RPE65基因?qū)?月齡的RPE65-/-狗，95 d后b波的閾值下降4個對數(shù)單位，接近于正常;振幅為正常的16%左右，感光細(xì)胞的振幅也為正常的16%，但對照組基本消失。Bemelmans等［5］將慢病毒介導(dǎo)的RPE65基因注射到RPE65-/-小鼠視網(wǎng)膜下腔內(nèi)，可以使RPE65基因在RPE持續(xù)表達(dá)，視網(wǎng)膜電圖記錄到的圖像與正常類似。RPE65基因轉(zhuǎn)移后至少4個月內(nèi)可以防止視錐細(xì)胞的退化，而對照組小鼠的視錐細(xì)胞則完全退化。Sarra等［6］發(fā)現(xiàn)將正常RHO基因?qū)胍暰W(wǎng)膜退化突變小鼠感光細(xì)胞后，可使感光細(xì)胞的酶活性和細(xì)胞功能恢復(fù)正常，且病毒滴度的增加可以提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和感光細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)起始速度。

1.4 基因沉默 目前研究認(rèn)為，ADRP的發(fā)病機制是由于感光細(xì)胞中出現(xiàn)異?；虍a(chǎn)物堆積，最后導(dǎo)致細(xì)胞壞死。正?；虻膶?dǎo)入并不能達(dá)到根本的治療目的，可行的方法是通過基因沉默使突變基因不表達(dá)或者少表達(dá)蛋白產(chǎn)物。

1.4.1 錘頭狀核酶 錘頭狀核酶是一種小型催化性RNA，具有催化裂解其他順式或反式RNA的功能，可識別特異性片段并產(chǎn)生裂解以催化清除異?；颉Ｄ壳板N頭狀核酶已應(yīng)用于獲得性免疫缺陷綜合征、帕金森病、血友病及RP等基因治療。Sullivan等［7］的體外研究證實錘頭狀核酶可以有效治療ADRP。Fritz等［8］設(shè)計了一套針對人類P23H視桿蛋白基因的錘頭狀核酶。A1i等［9］認(rèn)為錘頭狀核酶通過體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移，能使RPE細(xì)胞復(fù)雜的超微結(jié)構(gòu)缺陷在形態(tài)和功能上得到矯正。Gorbatyuk等［10］使用設(shè)計的錘頭狀核酶Rz397體外轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞與野生型RHO基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后1 d導(dǎo)致RHO mRNA表達(dá)下降60%;將AAV2-Rz397從視網(wǎng)膜下腔注入P6小鼠后發(fā)現(xiàn)，錘頭狀核酶可以顯著降低(≥50%)RHO基因在P6小鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)。Shaw等［11］將錘頭狀核酶導(dǎo)入P347L豬眼后證實錘頭狀核酶能靶向破壞P347L序列，從而發(fā)揮保護(hù)感光細(xì)胞的作用。

1.4.2 RNA 干擾 RNA 干擾(RNA interference，RNAi)現(xiàn)象廣泛存在于動植物的細(xì)胞中，是機體為適應(yīng)環(huán)境變化而在蛋白翻譯水平進(jìn)行調(diào)控的重要機制。與目的基因序列同源的雙鏈小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)進(jìn)入細(xì)胞后導(dǎo)致的基因轉(zhuǎn)錄后沉默現(xiàn)象稱為RNAi。RNAi近幾年來成為眼科治療ADRP的新研究方向。Georgiadis等［12］使用重組腺病毒轉(zhuǎn)錄的針對外周蛋白-2(Prph2)基因的siRNA研究小鼠視網(wǎng)膜上Prph2基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的siRNA可以有效且特異地使Prph2基因沉默，在小鼠活體經(jīng)視網(wǎng)膜下腔注射后3周開始抑制Prph2基因的表達(dá)。Chadderton等［13］最近利用RNAi技術(shù)在ADRP小鼠模型視網(wǎng)膜下腔注射攜帶針對突變RHO siRNA的重組腺病毒載體，同時聯(lián)合移植鼠源性野生型RHO基因，利用視網(wǎng)膜電圖評估療效，結(jié)果表明突變點RNAi聯(lián)合RHO基因移植可以有效治療RHO基因突變引起的ADRP。O’Reilly等［14］同樣利用RNAi技術(shù)聯(lián)合野生型RHO基因轉(zhuǎn)入小鼠活體實驗和細(xì)胞實驗均證實針對突變RHO基因的siRNA能抑制90%突變型RHO基因的表達(dá)，同時導(dǎo)入的野生型RHO基因能夠正常表達(dá)。

1.5 凋亡抑制 Bcl-2家族是研究及應(yīng)用最廣泛的一種抑制凋亡的基因，Bcl-2的表達(dá)具有保護(hù)光感受器細(xì)胞的作用，然而其過度表達(dá)也可導(dǎo)致大鼠光感受器細(xì)胞死亡，其原因尚不清楚，可能是Bcl-2基因的過度表達(dá)破壞了Bcl-2/Bax的平衡。Bcl-2也能抑制γ-PDE基因突變引起感光細(xì)胞的凋亡［15］。Yoshizawa等［16］研究發(fā)現(xiàn)，由甲基亞硝基脲誘導(dǎo)的小鼠RP是可以高度再生的，機制主要與Bcl-2蛋白減少、Bax蛋白增加等有關(guān)。Murakami等［17］證實細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子途徑在神經(jīng)保護(hù)作用中有著重要的地位，該研究表明細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子可以上調(diào)Bcl-2表達(dá)，最終導(dǎo)致感光細(xì)胞的凋亡。

2 干細(xì)胞移植

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞是一項創(chuàng)新技術(shù)，可以作為一個無限細(xì)胞分化或組織工程來源。最近研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞具有治療 RP等疾病的潛力［18］。Smith等［19］將自體同源骨髓衍生的家族陰性的造血干細(xì)胞注入大鼠的退行性靜脈中，可以在一定程度上防治視錐細(xì)胞的死亡，保護(hù)中心椎體視覺且沒有明顯的排異反應(yīng)。Idelson等［20］利用特定的培養(yǎng)方法，使具有多能分化潛力的人類胚胎干細(xì)胞成功培養(yǎng)分化出功能形態(tài)學(xué)上都正常的RPE細(xì)胞。為將來治療因RPE細(xì)胞異常機能障礙引起的RP提供依據(jù)。Wang等［21］在一項非侵襲性干細(xì)胞治療的研究中發(fā)現(xiàn)，在RP大鼠模型的感光細(xì)胞還沒有大量喪失之前，在大鼠尾靜脈注射干細(xì)胞進(jìn)行治療，當(dāng)未治療的大鼠感光細(xì)胞只有1～2層時，經(jīng)過干細(xì)胞注射治療，大鼠感光細(xì)胞增加至5～6層。

3 視網(wǎng)膜移植

RP是由于感光細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致感光細(xì)胞功能的喪失［22］。因此RPE移植研究思路即是將RPE細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后，注入視網(wǎng)膜下腔或?qū)⒑琑PE細(xì)胞和感光細(xì)胞片的視網(wǎng)膜用手術(shù)的方法直接植入受體視網(wǎng)膜下腔，用來補充或修復(fù)凋亡的RPE細(xì)胞和感光細(xì)胞，以達(dá)到治療目的。視網(wǎng)膜移植的方法主要分為細(xì)胞移植和組織場面移植。

3.1 細(xì)胞移植 可進(jìn)行移植的細(xì)胞包括感光細(xì)胞、RPE細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和雪旺細(xì)胞等。通常所說的視網(wǎng)膜細(xì)胞移植是指感光細(xì)胞和RPE細(xì)胞移植。Gouras等［23］將正常小鼠中分離的RPE細(xì)胞移植到RPE65-/-變性小鼠的視網(wǎng)膜下腔，對照組注射生理鹽水。結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植后RPE65-/-小鼠外核層厚度較對照組明顯增厚，同時3.7周后小鼠視網(wǎng)膜電圖顯示振幅明顯增大，提示RPE移植是治療RP的有效方法之一。Sauve等［24］在RP大鼠的視網(wǎng)膜下腔注射人類衍生RPE細(xì)胞株ARPE-19，可以部分保留視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞的視網(wǎng)膜電圖功能。Gouras等［25］首先報道酶解Bruch膜RPE移植術(shù)，他們將人RPE細(xì)胞經(jīng)處理后直接注射于猴的Bruch膜，術(shù)后2 h內(nèi)，移植的RPE細(xì)胞可與宿主Bruch膜黏合，形成一層類上皮樣細(xì)胞層，病理檢查發(fā)現(xiàn)被移植的RPE細(xì)胞形態(tài)及功能均正常，說明這一方法的可行性。

3.2 視網(wǎng)膜組織塊移植 Yang等［26］將正常的大鼠光感受器及視網(wǎng)膜移植到3個月大的P23H大鼠(Pro-23-His視紫紅質(zhì)大鼠)，6個月后評估視功能和視錐細(xì)胞計數(shù)。研究發(fā)現(xiàn)移植后的視錐細(xì)胞損傷減少了10%，同時視網(wǎng)膜電圖發(fā)現(xiàn)b波振幅增加了78%。Woch等［27］將新生鼠的視網(wǎng)膜片植入37～69 d RP大鼠的視網(wǎng)膜下腔，移植63 d～10個月后，大鼠上丘腦刺激實驗證實植入的視網(wǎng)膜片具有應(yīng)答反應(yīng)。Arai等［28］將完整的視網(wǎng)膜片移植入RP大鼠視網(wǎng)膜后，可以記錄到上丘對閃光的視反應(yīng)。

4 神經(jīng)營養(yǎng)因子

神經(jīng)營養(yǎng)因子是一類對神經(jīng)系統(tǒng)分化、發(fā)育、神經(jīng)元存活、軸突再生有著重要作用的細(xì)胞因子。相關(guān)研究已經(jīng)證實眼組織中存在著神經(jīng)營養(yǎng)因子，包括睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、晶狀體上皮源性生長因子、肝細(xì)胞源性生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)等，且許多已應(yīng)用于治療各種神經(jīng)退行性疾?。?9］。研究表明各種神經(jīng)營養(yǎng)因子通過玻璃體腔及視網(wǎng)膜下腔注射可以有效挽救RP動物模型的感光細(xì)胞，神經(jīng)營養(yǎng)因子多與基因治療相結(jié)合。CNTF已經(jīng)被證實具有視網(wǎng)膜保護(hù)作用，且不會引起視網(wǎng)膜下膠質(zhì)細(xì)胞增生［30］。Rhee等［31］將 rAAV 介導(dǎo)的 CNTF 注射到 RP小鼠視網(wǎng)膜下腔，發(fā)現(xiàn)可以維持感光內(nèi)視紫紅質(zhì)的表達(dá)。Azadi等［32］將CNTF聯(lián)合BDNF移植治療RP小鼠，發(fā)現(xiàn)治療后小鼠TUNEL染色陽性的光感受器細(xì)胞數(shù)量較對照組明顯下降，同時體內(nèi)可以檢測到內(nèi)源性CNTF表達(dá)顯著增高，證明CNTF聯(lián)合BDNF治療有確定的神經(jīng)保護(hù)作用。Zhang等［33］將BDNF質(zhì)粒注入RCS大鼠視網(wǎng)膜下腔或者玻璃體腔后再行電穿孔術(shù)治療RP，發(fā)現(xiàn)治療組和對照組視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞凋亡率有明顯的差異，證明BDNF移植是治療RP的有效方法之一。

5 人工視力

人工視力主要包括視盤植入微電極、視網(wǎng)膜下腔植入人工視網(wǎng)膜硅芯片以及電針療法。Sakaguchi等［34］研究表明，將3個微電極植入已經(jīng)失明的RP患者的左眼視盤，6個月后，通過電刺激患者可以出現(xiàn)視覺反應(yīng)。通過刺激不同的電極患者產(chǎn)生視覺的部位及能感知的形狀也有所不同。在隨后的隨訪中沒有發(fā)現(xiàn)任何并發(fā)癥，提示通過植入電極可以有效地修復(fù)視覺缺損。Chow等［35］研究表明，將人工視網(wǎng)膜硅芯片植入6位患者的右眼，在隨后的6～18個月隨訪中，芯片依靠自帶的電量發(fā)揮一定的功能，沒有移植排異等反應(yīng)，所有患者的視覺都得到一定的改善。

6 其他

Tam等［36］研究表明RHO基因突變引起的RP存在光依賴性。它們在RHO突變基因的小鼠動物模型中進(jìn)行綠光照射刺激，發(fā)現(xiàn)可以誘發(fā)其感光細(xì)胞的變性，因此臨床上應(yīng)給予配戴墨鏡等處理以減少光源對眼視網(wǎng)膜的損傷。另外，還可以通過我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的針灸、中藥等聯(lián)合治療改善視網(wǎng)膜微循環(huán)，進(jìn)而緩解感光細(xì)胞的凋亡。

7 總結(jié)

基因治療將成為RP治療的主要方法，RP基因治療已經(jīng)通過了最初的實驗階段，但在基因治療過程中，其有效性、給藥途徑、載體的安全性等問題還有待于廣大眼科工作者進(jìn)行深入地研究。希望這些新技術(shù)、新療法能盡早實現(xiàn)治療RP的目標(biāo)，相信在不久的將來，這些新療法能夠安全有效地治療RP，為RP患者帶來福音。

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