宋作慶 徐蕭洪 周清華

1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院肺部腫瘤外科，天津市肺癌研究所，天津肺癌轉(zhuǎn)移與腫瘤微環(huán)境重點實驗室；2.天津醫(yī)科大學(xué)護理學(xué)院內(nèi)外科教研室

據(jù)WHO資料報告，癌癥是發(fā)病率和死亡率增長最快，對人類健康和生命威脅最大的疾病，外科手術(shù)目前仍然是治療癌癥的首選方法。傳統(tǒng)的外科手術(shù)雖有立竿見影的效果，但無法解決復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移問題；放射療法雖然療效確切，但特異性較差限制了其廣泛應(yīng)用；化學(xué)療法雖然可對實體瘤和血液系統(tǒng)腫瘤起效，但不良反應(yīng)較大，容易產(chǎn)生耐藥性；現(xiàn)有的物理治療方法，包括熱療法、磁療法、高強度聚焦超聲療法，由于設(shè)計原理和使用方法的局限性，都存在不同程度的缺陷；新近出現(xiàn)的免疫療法和基因療法雖然不良反應(yīng)較小，但其療效和確切機制仍有待進(jìn)一步臨床驗證。為此人們一直在尋求更為有效的腫瘤治療策略。

G.A.Hofmann 等[1]根據(jù)細(xì)胞的可逆性電擊穿特性提出了癌癥的電穿孔療法(EPT)，隨著電脈沖劑量的增加，細(xì)胞出現(xiàn)不可恢復(fù)的破裂導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這種現(xiàn)象稱作不可逆性電擊穿(IREB)[2]，目前有研究采用了一種上升時間為ns級的指數(shù)衰減脈沖——陡脈沖作用于腫瘤細(xì)胞，它可使腫瘤細(xì)胞膜發(fā)生不可逆性電擊穿導(dǎo)致細(xì)胞死亡，對于深入開展陡脈沖對腫瘤細(xì)胞的作用機理與靶向性治療及臨床應(yīng)用研究具有重要的科學(xué)意義，已引起國內(nèi)外同行的高度關(guān)注。

1 脈沖治療腫瘤的基本機制

Karl H.Schoenbach等[3]發(fā)現(xiàn)不用化療藥物，單獨使用電場度為26～300kV/cm、脈沖寬度為10～300ns的脈沖電場可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞程序性死亡(凋亡)并能有效抑制腫瘤的生長。將適當(dāng)?shù)碾娒}沖引入到癌癥組織中，使惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生不可逆性電擊穿，破壞腫瘤的生存條件，達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。

陡脈沖不可逆性電擊療法基于電穿孔理論，是通過在降低電壓峰值和脈寬、提高頻率，上升時間為納秒級的持續(xù)指數(shù)衰減脈沖引入腫瘤組織中，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生電穿孔、電處理以及不可逆性電擊穿等生物電效應(yīng)，殺傷腫瘤細(xì)胞、抑制腫瘤細(xì)胞增殖，從而達(dá)到治療腫瘤的目的[4]，其主要機制如下。

1.1 陡脈沖作用下細(xì)胞的電場分布細(xì)胞的跨膜電位是維持細(xì)胞生理功能的極為重要的參數(shù)。陡脈沖的電場基本特性是對處于場中的物質(zhì)有力的作用。細(xì)胞膜和核膜內(nèi)外表面有很強的電場分布，同時由于細(xì)胞膜的介電常數(shù)與細(xì)胞外液、細(xì)胞質(zhì)的不同，核膜的介電常數(shù)與細(xì)胞質(zhì)、核仁的不同，從電磁基本理論出發(fā)，必然有作用于細(xì)胞膜和核膜表面的電場力。

1.2 電場應(yīng)力的不可逆性電擊穿機理對于生物膜結(jié)構(gòu)，液態(tài)鑲嵌模型是普遍接受的模型。在陡脈沖的電場應(yīng)力作用下，細(xì)胞膜和核膜會出現(xiàn)電穿孔現(xiàn)象，膜微孔量增大，大量的離子通過膜的離子通道，打破了細(xì)胞內(nèi)外的離子平衡，引起各種細(xì)胞破裂等生物物理現(xiàn)象的發(fā)生，對細(xì)胞膜和核膜的膜結(jié)構(gòu)造成不可恢復(fù)性的破壞。

1.3 不可逆性電擊穿直接作用陡脈沖作用于腫瘤細(xì)胞時，細(xì)胞膜、核膜等處于不斷地充放電動態(tài)過程，從而在膜中及其周圍形成電場。因膜的介電常數(shù)與周圍原生質(zhì)的介電常數(shù)不等，必然存在作用于膜上的電場力，使細(xì)胞膜厚度不斷變薄，最后導(dǎo)致其發(fā)生穿孔；平時不能通過細(xì)胞膜的離子、分子等此時大量涌入，對細(xì)胞膜、細(xì)胞核、核仁、線粒體等造成很高的腫脹壓力，使其發(fā)生不可逆性電擊穿并導(dǎo)致死亡。

1.4 改變生存環(huán)境研究發(fā)現(xiàn)陡脈沖可以導(dǎo)致電極針陽極區(qū)腫瘤組織呈脫水狀態(tài)，陰極去腫瘤組織呈水腫反應(yīng)。腫瘤細(xì)胞及周圍組織的pH值改變，使細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度降低，腫瘤細(xì)胞酶的活性破壞，組織蛋白壞死變性、凝固沉淀，最終導(dǎo)致腫瘤組織的死亡。

米彥[5]等實驗中，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度檢測實驗發(fā)現(xiàn)，陡脈沖電場刺激能夠使肝癌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度發(fā)生變化，變化的程度與陡脈沖電場的參數(shù)有關(guān)。采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察到肝癌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度發(fā)生變化，使得細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度穩(wěn)態(tài)失調(diào)或大幅度振蕩，從而有可能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；流式細(xì)胞術(shù)Annexin V 凋亡檢測結(jié)果證實了陡脈沖電場能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，并且較低的電壓峰值、較寬的脈沖寬度比較高的電壓峰值、較窄的脈沖寬度能更有效地誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。

1.5 脈管效應(yīng)陡脈沖作用組織后，可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞及肌層呈凝固性壞死，影響組織血供，導(dǎo)致細(xì)胞死亡；可非選擇性殺傷靶區(qū)腫瘤組織邊緣的毛細(xì)淋巴管，有效減少治療后局部殘留的瘤細(xì)胞通過腫瘤邊緣的毛細(xì)淋巴管轉(zhuǎn)移到其他部位的可能性。

1.6 凋亡作用研究發(fā)現(xiàn)陡脈沖治療組的細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組，且凋亡細(xì)胞伴有Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)比值的降低。由此可推測陡脈沖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡且可能是通過Bcl-2與Bax蛋白的調(diào)節(jié)來實現(xiàn)的。

1.7 降低血流灌注，激活機體免疫系統(tǒng)國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)[6]發(fā)現(xiàn)陡脈沖作用可減少腫瘤血流灌注60%～70%，導(dǎo)致腫瘤生長延遲0.2d。但是這種血流的改變只是暫時的，持續(xù)1h左右開始恢復(fù)，并在24h內(nèi)達(dá)正常水平。有學(xué)者[7]在陡脈沖治療兔肝VX2鱗癌的實驗中發(fā)現(xiàn)，EP作用后局限于脈沖電場區(qū)域的腫瘤組織顏色發(fā)生改變。隨后瘤體內(nèi)注射熒光素，在鎢燈照明下觀察到脈沖作用區(qū)組織無染料著色，表明血流灌注被切斷，大約15～20min后開始逐漸恢復(fù)。并且在電極針插入處無出血現(xiàn)象。實驗中也觀察到陡脈沖電場致腫瘤組織顏色變化，組織切面有瘀血區(qū)。據(jù)此推測陡脈沖電場作用可能導(dǎo)致腫瘤組織血流灌注降低，造成組織缺氧而抑制腫瘤細(xì)胞的生長。另外，還觀察到腫瘤組織周圍有單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的浸潤。提示陡脈沖電場可能激活了機體免疫系統(tǒng)，從而進(jìn)一步抑制腫瘤的生長。

2 脈沖治療的研究及療效

2.1 體外細(xì)胞實驗熊蘭[8]等應(yīng)用不同劑量的脈沖，分別處理良性腫瘤和惡性腫瘤。從實驗現(xiàn)象和結(jié)果來看，脈沖使腫瘤組織發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)和組織結(jié)構(gòu)的改變，破壞了腫瘤組織的生存環(huán)境。腫瘤組織發(fā)生多種病理反應(yīng)，細(xì)胞核固縮、細(xì)胞膜崩潰、線粒體消失、核蛋白凝固壞死，導(dǎo)致腫瘤組織的死亡。

研究發(fā)現(xiàn)陡脈沖作用人卵巢腺癌細(xì)胞株SKOV3后細(xì)胞發(fā)生明顯腫脹，細(xì)胞核固縮掃描電鏡顯示細(xì)胞膜出現(xiàn)孔洞并發(fā)生破裂，細(xì)胞質(zhì)外噴透射電鏡發(fā)現(xiàn)核腫脹，核膜不完整，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)模糊，微絨毛腫脹，胞漿、線粒體腫脹、空泡化，細(xì)胞膜多處斷裂。表明陡脈沖使惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生不可逆性電擊穿并導(dǎo)致其死亡。

2.2 動物實驗陡脈沖在動物實驗研究中已經(jīng)涉及到各類實體腫瘤，包括肝腫瘤、纖維肉瘤、骨肉瘤、黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌、舌癌、皮膚癌等，并對動物的肝癌模型、胰腺癌模型、前列腺癌模型和皮膚腫瘤模型[9,10]等施行了體內(nèi)IRE手術(shù)，均取得了良好的治療效果，為臨床試驗提供了詳實的理論和豐富的實踐經(jīng)驗。

Salomskaite_Davalgiene S等[11]分析了電脈沖對鼠肺癌組織的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)給予1300V/cm，持續(xù)0.1ms的電脈沖刺激時，通過光電鏡觀察到治療后腫瘤組織壞死明顯增加，腫瘤細(xì)胞間隙變大，量細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，可見細(xì)胞膜及核膜破裂。姚陳果等[12]研究了電脈沖對人卵巢腺癌、胃癌、直腸癌等活體腫瘤組織的作用，發(fā)現(xiàn)陽極區(qū)因脫水而呈現(xiàn)凝固性壞死。

姚陳果[13]等在對鼠癌細(xì)胞的研究，從實驗結(jié)果和光鏡觀察，可以看到陡脈沖電場作用在靠近兩針電極處，尤其是在陽極區(qū)對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用明顯，呈凝固性壞死征象，這可能與惡性腫瘤細(xì)胞具負(fù)電性有關(guān)；而進(jìn)一步從超微結(jié)構(gòu)變化分析揭示陡脈沖電場作用同樣可先引起細(xì)胞質(zhì)膜的通透性增加，使得細(xì)胞內(nèi)外液離子平衡被打破，并隨作用時間的延長，最終導(dǎo)致細(xì)胞生物膜系統(tǒng)不可逆性電穿，整個細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞而死亡。因此，可以推測陡脈沖電場作用可通過不可逆性電擊穿直接殺傷腫瘤細(xì)胞，呈現(xiàn)急性損傷效應(yīng)。

3 展望

陡脈沖的電穿孔治療癌腫是有效的，與其他局部療法相比具有較多的優(yōu)越性。陡脈沖在腫瘤治療上的應(yīng)用前景取決于：首先要能對腫瘤組織產(chǎn)生有效的損傷，其次是所致壞死組織的轉(zhuǎn)歸如何，再者就是對靶組織鄰近的組織器官是否安全。從目前的實驗中可見陡脈沖在有效殺傷腫瘤組織的同時，對主要臟器及對靶區(qū)周圍組織都是安全的，在壞死的腫瘤組織與瘤周正常組織間有清晰的界限。未見明顯的膽漏、出血、針道轉(zhuǎn)移等不良反應(yīng)。研究表明單純采用陡脈沖來治療腫瘤是可行的，電脈沖療法在前期的研究中取得了顯著的成績。但是電脈沖治療儀器的研制、治療機制的完善、臨床試驗的開展、最佳參數(shù)的選擇，殘存腫瘤細(xì)胞的處理及安全性等都有待進(jìn)一步的研究，尚需通過大量的動物和臨床實驗來尋求最佳的治療劑量和解決殘留癌細(xì)胞等一系列問題。只有不斷地在實踐中積累經(jīng)驗，使之日趨成熟。陡脈沖技術(shù)有望成為腫瘤綜合治療中前景廣闊的新替代療法。總之，腫瘤的電穿孔治療是一項多學(xué)科交叉的、綜合性的研究課題，這項技術(shù)還需在實踐中不斷探索、完善以造福于人類。

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