朱洪竹，朱梅菊 ，褚洪標(biāo)，肖國強(qiáng)

毛蕊花苷和馬蒂苷對遞增大強(qiáng)度運動大鼠骨骼肌細(xì)胞線粒體鈣含量和肌漿網(wǎng)Ca2+－ATP酶活性的影響*

朱洪竹1，2，朱梅菊2*，褚洪標(biāo)3，肖國強(qiáng)1

(1.華南師范大學(xué) 體育科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510631;2.井岡山大學(xué)體育學(xué)院，江西吉安 343009;3.井岡山大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江西 吉安 343009)

目的:研究毛蕊花苷和馬蒂苷對遞增大強(qiáng)度運動大鼠骨骼肌細(xì)胞內(nèi)線粒體鈣含量和肌漿網(wǎng)Ca2+－ATP酶活性的影響。方法:將40只大鼠隨機(jī)分成正常對照組，單純運動組，運動+毛蕊花苷組和運動+馬蒂苷組。每組10只。觀察毛蕊花苷和馬蒂苷對運動大鼠體重等一般情況、跑臺力竭時間和線粒體鈣含量、肌漿網(wǎng)Ca2+－ATP酶活性的影響。結(jié)果:實驗第三周末運動+毛蕊花苷組和運動+馬蒂苷組疲勞相關(guān)癥狀明顯減輕，食欲增加，體重增加。運動+毛蕊花苷組和運動+馬蒂苷組大鼠跑臺力竭時間顯著長于單純運動組，P＜0.01，P＜0.05。運動+毛蕊花苷組大鼠跑臺力竭時間長于運動+馬蒂苷組，P＜0.05。單純運動組大鼠骨骼肌細(xì)胞線粒體鈣含量明顯高于正常對照組;而肌漿網(wǎng)Ca2+－ATP酶活性明顯低于正常對照組，均P＜0.01。運動+毛蕊花苷組和運動+馬蒂苷組大鼠骨骼肌細(xì)胞線粒體鈣含量顯著低于單純運動組，均P＜0.01;而肌漿網(wǎng)Ca2+－ATP酶活性均明顯高于單純運動組，P＜0.01，P＜0.05。運動+毛蕊花苷組大鼠骨骼肌細(xì)胞線粒體鈣含量低于運動+馬蒂苷組，P＜0.01;而肌漿網(wǎng)Ca2+－ATP酶活性明顯高于運動+馬蒂苷組，P＜0.05。結(jié)論:毛蕊花苷和馬蒂苷可能通過提高遞增大強(qiáng)度運動大鼠骨骼肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)Ca2+－ATP酶活性，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+轉(zhuǎn)運，從而表現(xiàn)出較明顯的抗運動性疲勞和提高大鼠運動能力作用。且毛蕊花苷的作用強(qiáng)于馬蒂苷。

毛蕊花苷，馬蒂苷，疲勞，鈣

馬先蒿屬植物如美觀馬先蒿和蜜穗馬先蒿等在中醫(yī)藥和民間中廣泛使用，多有滋陰補(bǔ)腎、補(bǔ)中益氣、健脾和胃作用，臨床用于治療虛弱、衰老等［1］。研究表明美觀馬先蒿(PediculaHs decora Franch)的根(太白參)能增強(qiáng)運動小鼠身體機(jī)能［2］，其冷提取物具有明顯的抗氧化損傷和延緩疲勞作用［3］。毛蕊花苷和馬蒂苷是馬先蒿屬植物的特征性成分［1］，屬于苯丙素苷類化合物，體外具有明顯的抗骨骼肌疲勞作用，體內(nèi)具有明顯的抗運動性疲勞和提高小鼠運動能力作用，且毛蕊花苷的作用比馬蒂苷更明顯［4，5］。本研究旨在進(jìn)一步研究其對遞增大強(qiáng)度運動大鼠骨骼肌細(xì)胞內(nèi)線粒體鈣含量和肌漿網(wǎng)Ca2+－ATP酶活性的影響，闡明其抗疲勞的作用機(jī)理，為尋找有效的純天然抗疲勞成分提供部分實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康雄性 SD大鼠40只，SPF級，6周齡，體重277.80±18.29g，由廣東醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。實驗動物適應(yīng)性喂養(yǎng)2天后，按完全隨機(jī)法分為正常對照組，單純運動組，運動+毛蕊花苷組，運動+馬蒂苷組。每組 10只，分籠飼養(yǎng)，自由飲食，室溫24℃ ～25℃。

1.2 毛蕊花苷和馬蒂苷的分離與提取

毛蕊花苷和馬蒂苷是本課題組從長舟馬先蒿中分離得到的［6］，放4℃冰箱保存?zhèn)溆??；衔锏慕Y(jié)構(gòu)見圖1。

1.3 藥物處理及給藥方法

毛蕊花苷和馬蒂苷分別用生理鹽水溶解，使用灌胃法，每天灌胃1次。藥物劑量換算參照文獻(xiàn)［7］。運動+毛蕊花苷組(毛蕊花苷，10mg/kg)，運動+馬蒂苷組(馬蒂苷，10mg/kg)。正常對照組和單純運動組以等體積生理鹽水(2ml/只)灌胃。每次實驗前2小時進(jìn)行灌胃，實驗時間3周。

圖1 毛蕊花苷和馬蒂苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.4 運動方式

除正常對照組不進(jìn)行任何運動訓(xùn)練外，各組動物在小動物跑臺(天津運動醫(yī)學(xué)研究所研制)上進(jìn)行跑臺訓(xùn)練，訓(xùn)練方案參照汶希等［8］介紹的大鼠運動性疲勞模型的建立。坡度為0°，運動訓(xùn)練方案見表1。每周7次，連續(xù)3周。第3周末除正常對照組外各組大鼠均進(jìn)行跑臺力竭訓(xùn)練，記錄力竭時間。力竭標(biāo)準(zhǔn)為連續(xù)施加機(jī)械刺激大鼠不能繼續(xù)跑動、下跑臺后腹部觸地嚴(yán)重呈“甲魚狀”。

1.5 指標(biāo)測定

大鼠力竭運動后即刻，2%戊巴比妥腹腔注射麻醉，迅速剖取動物右側(cè)股四頭肌肌腹，冷生理鹽水洗凈、剪碎，在冰裕上制備10%組織勻漿，按試劑盒操作步驟提取肌漿網(wǎng);在0－4℃條件下用差速離心法提取線粒體［9］。線粒體Ca2+含量采用MTB比色法測定;Ca2+－ATP酶采用定磷法測定;蛋白質(zhì)定量采用考馬氏亮藍(lán)法。除肌漿網(wǎng)提取試劑盒由上海紐杰美生物技術(shù)有限公司提供外，其余試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。所用試劑均為分析純或以上級別。按試劑盒說明書完成各項指標(biāo)的測定。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用單因素方差分析進(jìn)行均數(shù)間差異顯著性檢驗，顯著性水平α=0.05。統(tǒng)計學(xué)處理均在SPSS 10.0計算機(jī)統(tǒng)計軟件上完成。

2 結(jié)果

2.1 毛蕊花苷和馬蒂苷對跑臺運動大鼠體重等一般情況的影響

研究表明實驗第一周各組大鼠健康活潑，毛發(fā)光澤，食欲倍增，體重明顯增長。實驗第二周單純運動組大鼠食欲無明顯增加，體重有下降趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05;其余各組大鼠食欲與體重均增加。實驗第三周末，單純運動組大鼠活動減少，毛發(fā)枯萎，無光澤，食欲減少，體重下降，神疲乏力;而運動+毛蕊花苷組和運動+馬蒂苷組上述癥狀明顯減輕，食欲增加，體重增加;運動+毛蕊花苷組和運動+馬蒂苷組大鼠體重分別高于單純運動組大鼠，P＜0.01，P＜0.05;運動+毛蕊花苷組大鼠體重與運動+馬蒂苷組比較，差異無顯著性，P＞0.05;見表2。提示毛蕊花苷和馬蒂苷具有延緩運動性疲勞發(fā)生作用。

表2 各組大鼠體重的比較(g) (N=10)

2.2 毛蕊花苷和馬蒂苷對運動大鼠跑臺力竭時間的影響

本項研究表明單純運動組大鼠跑臺力竭時間明顯低于運動+毛蕊花苷組和運動+馬蒂苷組，P＜0.01，P＜0.05。運動+毛蕊花苷組大鼠跑臺力竭時間明顯高于運動+馬蒂苷組，P＜0.01，P＜0.05。見表3。提示毛蕊花苷和馬蒂苷具有提高遞增大強(qiáng)度運動大鼠運動能力作用，且毛蕊花苷的作用比馬蒂苷更明顯。

表3 各組大鼠跑臺力竭時間的比較(min)(N=10)

2.3 毛蕊花苷和馬蒂苷對運動大鼠骨骼肌細(xì)胞線粒體鈣含量的影響

本項研究表明單純運動組大鼠骨骼肌細(xì)胞線粒體鈣含量明顯高于正常對照組P＜0.01。而運動+毛蕊花苷組和運動+馬蒂苷組大鼠骨骼肌細(xì)胞線粒體鈣含量顯著低于單純運動組，均P＜0.01。運動+毛蕊花苷組大鼠骨骼肌細(xì)胞線粒體鈣含量低于運動+馬蒂苷組，P＜0.01。見表4。提示毛蕊花苷和馬蒂苷具有降低遞增大強(qiáng)度運動大鼠骨骼肌細(xì)胞線粒體鈣含量，減緩線粒體鈣超載作用;且毛蕊花苷的作用比馬蒂苷更明顯。

表4 各組大鼠骨骼肌細(xì)胞線粒體鈣含量的比較 (N=10)

2.4 毛蕊花苷和馬蒂苷對運動大鼠骨骼肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)Ca2+－ATP酶活性的影響

本項研究表明正常對照組大鼠骨骼肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)Ca2+－ATP酶活性明顯高于其余各組，P＜0.01，P＜0.05。運動+毛蕊花苷組和運動+馬蒂苷組大鼠骨骼肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)Ca2+－ATP酶活性明顯高于單純運動組，P＜0.01，P＜0.05。運動+毛蕊花苷組大鼠骨骼肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)Ca2+－ATP酶活性明顯高于運動+馬蒂苷組，P＜0.05。見表5。提示毛蕊花苷和馬蒂苷具有提高遞增大強(qiáng)度運動大鼠骨骼肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)Ca2+－ATP酶活性作用;且毛蕊花苷的作用比馬蒂苷更明顯。

表5 各組大鼠骨骼肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)Ca2+－ATP酶活性的比較 (N=10)

3 分析與討論

研究結(jié)果表明:通過3周遞增大強(qiáng)度運動以后，單純運動組大鼠出現(xiàn)了神疲乏力，活動減少，食欲降低，體重減輕，毛發(fā)欠光澤，稀疏等疲勞癥狀，而運動+毛蕊花苷組和運動+馬蒂苷組上述疲勞癥狀明顯減輕。單純運動組大鼠跑臺力竭時間短于運動+毛蕊花苷組和運動+馬蒂苷組，而運動+毛蕊花苷組大鼠跑臺力竭時間長于運動+馬蒂苷組，提示毛蕊花苷和馬蒂苷具有抗運動性疲勞和提高機(jī)體運動能力作用，且毛蕊花苷的作用更明顯。

線粒體是重要的呼吸器官，可通過Ca2+－ATP酶水解ATP主動攝取Ca2+。在生理條件下線粒體對細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)不起主要作用，只是與一定量的Ca2+結(jié)合，以維持其氧化磷酸化過程，提供肌肉活動所需能量。只有細(xì)胞功能異常，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度急劇升高時，線粒體才作為鈣貯存池聚集細(xì)胞內(nèi)多余的鈣［10］。研究表明大鼠急性力竭運動后，紅肌和白肌線粒體鈣含量都顯著增加，導(dǎo)致線粒體鈣超載［11］。本項研究亦表明單純運動組大鼠線粒體鈣含量顯著高于正常對照組，提示長期遞增大強(qiáng)度運動可導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞線粒體鈣超載。由于線粒體鈣超載，影響線粒體的呼吸功能，從而導(dǎo)致肌肉能量供應(yīng)障礙，可能是引起運動性疲勞的重要原因之一［11］。而運動+毛蕊花苷組和運動+馬蒂苷組骨骼肌細(xì)胞線粒體鈣含量明顯低于單純運動組。提示毛蕊花苷和馬蒂苷可能通過降低遞增大強(qiáng)度運動引起的線粒體鈣含量，減緩線粒體鈣超載，改善骨骼肌細(xì)胞的能量供應(yīng)，從而表現(xiàn)出較明顯的抗疲勞作用。

細(xì)胞內(nèi)肌漿網(wǎng)通過對Ca2+的攝取和釋放參與細(xì)胞內(nèi)鈣離子調(diào)節(jié)，尤其在肌肉的興奮－收縮偶聯(lián)中，肌漿網(wǎng)對Ca2+的變化起精細(xì)的調(diào)節(jié)作用。肌漿網(wǎng)主要通過兩個調(diào)節(jié)控制系統(tǒng)［12］:一是Ca2+－ATPase又稱鈣泵系統(tǒng)，將胞漿中游離Ca2+攝入肌漿網(wǎng)腔，使肌肉舒張;二是通道釋放系統(tǒng)，細(xì)胞興奮時，可迅速將肌漿網(wǎng)腔內(nèi)貯存的Ca2+釋放胞漿，引起肌肉收縮。本項研究表明單純運動組大鼠骨骼肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)Ca2+－ATP酶活性顯著低于正常對照組，提示長期遞增大強(qiáng)度運動可能通過使肌漿網(wǎng)Ca2+－ATP酶活性降低，影響肌漿網(wǎng)鈣泵系統(tǒng)將胞漿中游離多余鈣攝人肌漿網(wǎng)腔，導(dǎo)致Ca2+轉(zhuǎn)運功能改變，胞內(nèi)鈣濃度增加，使細(xì)胞內(nèi)線粒體鈣超載，從而影響肌肉收縮特性，導(dǎo)致運動性疲勞的發(fā)生。而運動+毛蕊花苷組和運動+馬蒂苷組肌漿網(wǎng)Ca2+－ATP酶活性明顯高于單純運動組。提示毛蕊花苷和馬蒂苷可能通過提高遞增大強(qiáng)度運動大鼠肌漿網(wǎng)Ca2+－ATP酶活性，降低線粒體鈣含量，減緩線粒體鈣超載，改善骨骼肌細(xì)胞的能量供應(yīng)和興奮—收縮偶聯(lián)，從而表現(xiàn)出較明顯的抗疲勞作用。

其次本項研究結(jié)果還表明毛蕊花苷的作用明顯強(qiáng)于馬蒂苷。我們推測這可能與這二個化合物的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。毛蕊花苷和馬蒂苷屬于苯丙素苷類化合物，研究表明這些苯丙素苷類化合物清除氧自由基和抗氧化的能力依賴于分子中羥基的數(shù)目，羥基越多，其清除氧自由基和抗氧化的能力就越強(qiáng)［13］，毛蕊花苷和馬蒂苷中均有兩個相同的苯酚環(huán)，毛蕊花苷的每個苯酚環(huán)上都有兩個鄰位羥基，而馬蒂苷中每個苯酚環(huán)上對應(yīng)的鄰位羥基中有一個被甲氧基取代。因此毛蕊花苷清除氧自由基和抗氧化的能力強(qiáng)于馬蒂苷［14］。本項研究結(jié)果是否提示其提高肌漿網(wǎng)Ca2+－ATP酶活性，減緩線粒體鈣超載的作用也可能依賴于分子中羥基的數(shù)目?這有待于更進(jìn)一步的研究。

4 小結(jié)

毛蕊花苷和馬蒂苷可能通過提高遞增大強(qiáng)度運動大鼠骨骼肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)Ca2+－ATP酶活性，降低線粒體鈣含量，減緩線粒體鈣超載，從而表現(xiàn)出較明顯的抗運動性疲勞和提高大鼠運動能力作用。且毛蕊花苷的作用強(qiáng)于馬蒂苷，這可能與化合物的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。

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Effects of Verbascoside and Martynoside from Pedicularis Dolichocymba on the Content of Ca2+Mitochondria and Ca2+－ATPase Activity in Sarcoplasmic Reticulum of Skeletal Muscle Cells in Overtrained Rats

ZHU Hong －zhu1，2，ZHU Mei－ju2*，CHU Hong － biao3，XIAO Guo －qiang1

(1 School of PE ＆ Sports Science，South China Normal University，Guangzhou，510631，China;2 School of PE ＆ Sports Science，Jinggangshan University，Jian，343009，China;3 School of medicine，Jinggangshan University，Jian，343009，China)

Objective:Effects of verbascoside and martynoside，two phenylpropanoid glycosides from Pedicularis dolichocymba were investigated on the content of Ca2+mitochondria and Ca2+－ATPase activity in sarcoplasmic reticulum of skeletal muscle cells in overtrained rats.Methods:Forty mice were randomly divided into 4 groups:the normal group，the exercise group，the exercise+verbascoside group and the exercise+martynoside group with ten rats in each group to study the effects of verbas-coside and martynoside on body weights，all－out time，the content of Ca2+mitochondria and Ca2+－ATPase activity in sarcoplasmic reticulum of skeletal muscle cells in overtrained rats.Results:After 3 － week experiment，verbascoside and martynoside obviously lessen symptoms related to fatigue and increase appetite and body weights of overtrained rats.The all－ out time of rats in the exercise+verbascoside group and the exercise+martynoside group were significantly longer than that of the exercise group(P ＜0.01，P ＜0.05).The all－out time of rats in the exercise+verbascoside group were longer than that of the exercise+martynoside group(P ＜0.05).The contents of Ca2+mitochondria of skeletal muscle cells in the exercise group was significantly higher than those in the normal group(P＜0.01)，while Ca2+－ATPase activities in sarcoplasmic reticulum of skeletal muscle cells were opposite(P ＜0.01).The contents of Ca2+mitochondria of skeletal muscle cells in the exercise+verbascoside group and the exercise+martynoside group were significantly lower than those of the exercise group(P ＜0.01)，and Ca2+－ATPase activities in sarcoplasmic reticulum of skeletal muscle cells were higher than those of the exercise group(P ＜0.01，P ＜0.05).The contents of Ca2+mitochondria of skeletal muscle cells in the exercise+verbascoside group were lower compared to the exercise+martynoside group(P＜0.01).The Ca2+－ATPase activities in sarcoplasmic reticulum of skeletal muscle cells in the exercise+verbascoside group were higher than those of the exercise+martynoside group(P ＜0.05).Conclusion:Verbascoside and martynoside were found to have significant effects in retarding fatigue，improving performance through increasing Ca2+－ATPase activity in sarcoplasmic reticulum of skeletal muscle cells in overtrained rats，facilitating cellular calcium transport.Verbascoside was however more active than martynoside.

Verbascoside;Martynoside;Fatigue;Calcium

G804.7

A

1007－323X(2012)04－0109－05

2011－10－25

朱洪竹(1976－)，女，湖南婁底人，講師，在讀博士研究生

研究方向:運動生理學(xué)

國家自然科學(xué)基金項目(項目編號:31160217)資助