姚 蕾，鐘淑霞，李珊山，宋 洋，郭靜微，謝曉蕾，艾 鶴

（吉林大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科，吉林 長(zhǎng)春130021）

自體黑素細(xì)胞移植治療不同臨床類型白癜風(fēng)患者的療效評(píng)價(jià)

Evaluation on curative effect of autologous melanocyte transplantation in treatment of patients with different clinical types of vitiligo

姚 蕾，鐘淑霞，李珊山，宋 洋，郭靜微，謝曉蕾，艾 鶴

（吉林大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科，吉林 長(zhǎng)春130021）

目的：評(píng)估自體黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)移植治療白癜風(fēng)的療效，并探討不同臨床分型、不同移植部位和不同病程白癜風(fēng)患者的療效差別，為該技術(shù)在臨床的應(yīng)用和推廣提供參考。方法：選擇穩(wěn)定時(shí)間均≥6個(gè)月、對(duì)藥物和光療反應(yīng)不佳的白癜風(fēng)患者34例，其中散發(fā)型12例，局限型13例，節(jié)段型9例；面頸發(fā)病17例，四肢及軀干發(fā)病12例，肢端發(fā)病5例。34例患者均采用自體黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)移植法治療，評(píng)價(jià)患者移植區(qū)復(fù)色面積比率及有無(wú)副作用 （疤痕形成、創(chuàng)面感染和原白斑擴(kuò)大）發(fā)生。結(jié)果：34例患者痊愈17例 （50.00%），顯效10例 （79.41%），有效6例 （97.06%），無(wú)效1例 （2.94%）。散發(fā)型移植者療效較局限型和節(jié)段型差 （P＝0.008）；肢端移植者效果較面頸、軀干和四肢移植者差 （P＝0.025）；病程長(zhǎng)短對(duì)療效無(wú)影響 （P＝1.000）。結(jié)論：自體黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)移植治療白癜風(fēng)效果良好，不同移植部位和臨床分型的白癜風(fēng)患者臨床療效不同。

白癜風(fēng)；黑素細(xì)胞；移植；療效

白癜風(fēng)是皮膚科常見的疑難病，嚴(yán)重時(shí)可以導(dǎo)致毀容，對(duì)患者的身心危害較大。白癜風(fēng)發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是表皮黑素細(xì)胞缺失導(dǎo)致白斑形成。如果白斑處黑素細(xì)胞完全喪失，則采用傳統(tǒng)的藥物和物理治療方法難以復(fù)色，此時(shí)需要外科治療將自體黑素細(xì)胞移入白斑區(qū)域。外科療法主要包括自體表皮片移植、自體表皮黑素細(xì)胞懸液移植和自體黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)移植等方法［1］。自體黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)移植通過(guò)負(fù)壓發(fā)皰取皮法取少量正常表皮，在體外對(duì)黑素細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，并擴(kuò)增至足夠數(shù)量后移植于白斑區(qū)。由于僅需較少的表皮即可培養(yǎng)出大量自體黑素細(xì)胞，因此可以最大限度降低供區(qū)取表皮片的數(shù)量［2］。該法不受受皮區(qū)形狀和皮膚弧度的限制，術(shù)后復(fù)色均勻，具有見效快、療效高和療程短等特點(diǎn)。目前國(guó)外僅有少數(shù)研究［3－5］分析了不同臨床分型、部位和病程的白癜風(fēng)患者應(yīng)用自體黑素細(xì)胞移植療法療效的差別，但國(guó)內(nèi)尚未見該方面的報(bào)道。本研究探討自體黑色素細(xì)胞移植治療不同臨床分型、不同部位和不同病程白癜風(fēng)患者的療效差別，旨在為該技術(shù)在臨床的應(yīng)用和推廣提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2009年10月—2011年2月在本科門診就診的白癜風(fēng)患者34例。入選標(biāo)準(zhǔn)：①病情穩(wěn)定時(shí)間≥6個(gè)月；②對(duì)藥物和光療反應(yīng)不佳；③無(wú)其他內(nèi)科疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠期及哺乳期；②瘢痕體質(zhì)患者。34例患者中男性15例，女性19例；年齡5～48歲，平均年齡 （23.76±8.05）歲；病程：≤1年者15例，2～5年者9例，＞5年者10例；臨床類型：散發(fā)型者12例，局限型者13例，節(jié)段型者9例；面頸部17例，四肢及軀干12例，肢端5例。

1.2 主要試劑

F12培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；EDTA、G－418、3－異丁基－1－甲基黃嘌呤 （3－isobuty－1－methylxanthine，IBMX） 和 堿 性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 （basic fibroblast growth factor，b－FGF）購(gòu)自Sigma公司；黑素細(xì)胞培養(yǎng)使用 Hu16培養(yǎng)基［3］。

1.3 黑素細(xì)胞培養(yǎng)及移植方法

1.3.1 術(shù)前準(zhǔn)備 詳細(xì)記錄患者信息，與患者或患者家屬進(jìn)行治療前溝通，使其對(duì)整個(gè)治療過(guò)程有所了解后，簽知情同意書并拍照。該研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)討論同意。

1.3.2 黑素細(xì)胞的分離培養(yǎng) 采用凸凹型吸盤，75%酒精消毒供皮區(qū)，用BFY－IIIA皮膚分離儀在供皮區(qū)進(jìn)行負(fù)壓吸引發(fā)皰，工作負(fù)壓為40～60kPa，40～60min后發(fā)皰完成，用碘伏和75%酒精消毒水皰區(qū)皮膚，用眼科剪沿皰壁邊緣剪下皰壁，于37℃、0.25%胰酶消化10min，立體顯微鏡下刮下表皮細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于Hank’s液中，用過(guò)濾器過(guò)濾后低速離心5min，棄上清，置于含Hu16培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)3d，加入G－418（終濃度為100mg·L－1）以除去雜細(xì)胞，1周后即可得到高純度的黑素細(xì)胞 （圖1，見插頁(yè)四）。當(dāng)黑素細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)傳代 （圖2，見插頁(yè)四）。每次傳代和移植時(shí)均計(jì)數(shù)黑素細(xì)胞、測(cè)定黑素含量并計(jì)算黑素細(xì)胞倍增時(shí)間［6］，以評(píng)估黑素細(xì)胞生長(zhǎng)情況及其功能。移植前用0.25%胰酶－EDTA消化黑素細(xì)胞后分置2個(gè)離心管，其中4／5細(xì)胞用于移植，1／5細(xì)胞繼續(xù)傳代。計(jì)數(shù)用于移植的黑素細(xì)胞，離心后棄上清，加入F12培養(yǎng)液制成黑素細(xì)胞懸液備用。

1.3.3 白斑區(qū)去表皮 白斑區(qū)用5%利多卡因乳膏局麻60min后，常規(guī)消毒，采用超脈沖CO2激光進(jìn)行磨削，磨削后即刻用無(wú)菌生理鹽水棉簽擦拭去除表皮。將制備好的黑素細(xì)胞懸液均勻鋪種于移植區(qū)創(chuàng)面，細(xì)胞數(shù)量控制在 （6～10）×104cm－2［2］。鋪種后用油紗覆蓋，油紗上面覆蓋培養(yǎng)液浸濕的無(wú)菌紗布及干紗布。包扎完畢后患者靜臥至少1h。

1.4 療效評(píng)價(jià)方法

每次移植前和移植結(jié)束后6個(gè)月復(fù)診，由同一工作人員于同一地點(diǎn)用同一數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行拍照，記錄治療前后白斑面積，評(píng)價(jià)移植區(qū)復(fù)色面積比率和有無(wú)副作用發(fā)生。副作用包括疤痕形成、創(chuàng)面感染和原白斑擴(kuò)大。療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［7］：痊愈，移植區(qū)復(fù)色面積為90%～100%；顯效，復(fù)色面積達(dá)50%～89%；有效，復(fù)色面積達(dá)20%～49%；無(wú)效，白斑區(qū)復(fù)色面積＜20%。有效率＝ （痊愈例數(shù)＋顯效例數(shù)＋有效例數(shù)）／總例數(shù)×100%；顯效率＝ （痊愈例數(shù)＋顯效例數(shù)）／總例數(shù)×100%；痊愈率＝痊愈例數(shù)／總例數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。不同臨床分型、不同移植部位和不同病程患者移植后顯效率比較采用卡方檢驗(yàn)，不滿足卡方檢驗(yàn)條件時(shí)使用Fisher確切概率法。

2 結(jié) 果

移植面積為2～65cm2，平均移植面積為（16.66±14.98）cm2。34例患者痊愈17例，顯效10例，有效6例，無(wú)效1例，痊愈率為50%，顯效率為79.41%，有效率為97.06%。34例患者無(wú)治療副作用出現(xiàn)。不同臨床分型白癜風(fēng)患者療效：12例散發(fā)型患者，痊愈2例，顯效4例，有效5例，無(wú)效1例，顯效率為50%；13例局限型患者，痊愈10例，顯效2例，有效1例，無(wú)效0例，顯效率為92.31%；9例節(jié)段型患者，痊愈5例，顯效4例，有效及無(wú)效均為0例，顯效率為100%。不同臨床分型白癜風(fēng)患者療效差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.008）。不同移植部位患者療效：面頸部患者共17例，痊愈12例，顯效4例，有效1例，無(wú)效0例，顯效率為94.12%；四肢及軀干患者共12例，痊愈5例，顯效4例，有效2例，無(wú)效1例，顯效率為75.0%；肢端部位患者5例，痊愈0例，顯效2例，有效3例，無(wú)效0例，顯效率為40%。不同移植部位患者療效差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.025）。不同病程白癜風(fēng)患者療效：≤1年者15例，痊愈9例，顯效3例，有效3例，無(wú)效0例，顯效率為80.0%；2～5年者9例，痊愈3例，顯效4例，有效2例，無(wú)效0例，顯效率為77.78%；＞5年者10例，痊愈5例，顯效3例，有效1例，無(wú)效1例，顯效率為80.0%。不同病程白癜風(fēng)患者療效差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＝1.000）。見表1～3。

表1 不同臨床分型白癜風(fēng)患者自體黑素細(xì)胞培養(yǎng)移植療效的比較Tab.1 Comparison of the curative effects of autologous melanocyte transplantation in treatment of patients with different clinical types of vitiligo

表2 不同移植部位白癜風(fēng)患者自體黑素細(xì)胞培養(yǎng)移植療效的比較Tab.2 Comparison of the curative effects of autologous melanocyte transplantation in treatment of patients with vitiligo at different transplantation locations

表3 不同病程白癜風(fēng)患者自體黑素細(xì)胞培養(yǎng)移植療效比較Tab.3 Comparison of the curative effects of autologous melanocyte transplantation in treatment of patients with different disease durations of vitiligo

3 討 論

對(duì)于穩(wěn)定期白癜風(fēng)，當(dāng)非外科療法如藥物和光療效果不理想時(shí)，可選擇外科療法。自體黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)可獲得足夠數(shù)量的黑素細(xì)胞，受皮與供皮的比例更大［8］，故適用于治療面積較大的頑固性穩(wěn)定期白癜風(fēng)。本研究結(jié)果顯示：自體黑素細(xì)胞移植治療白癜風(fēng)效果良好，移植有效率達(dá)97.06%，這與Hong等［4］的報(bào)道近似。本研究結(jié)果表明：白癜風(fēng)臨床類型和白斑部位可影響自體黑素細(xì)胞移植的療效，其中局限型與節(jié)段型白癜風(fēng)治療效果要好于散發(fā)型，與以往報(bào)道［4－5］一致。面、頸部的白斑治療效果最好，其次為軀干及四肢，肢端尤其是手指等活動(dòng)度大的部位治療效果相對(duì)較差，但Olsson等［5］研究顯示：軀干及四肢效果好于面頸部，而膝部、肘部等效果最差；朱美財(cái)?shù)龋?］研究發(fā)現(xiàn)：下肢、軀干、面部白癜風(fēng)治療效果較好，而頸部、眼瞼、嘴唇相對(duì)較差，但未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。本研究結(jié)果顯示：白癜風(fēng)病程長(zhǎng)短不影響自體黑素細(xì)胞移植的效果，而Olsson等［5］認(rèn)為：穩(wěn)定期白癜風(fēng)病程越長(zhǎng)移植效果越差，其差異尚需加大樣本量和延長(zhǎng)隨訪時(shí)間以進(jìn)一步研究。

自體黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)移植療法的技術(shù)關(guān)鍵在于體外培養(yǎng)的黑素細(xì)胞的質(zhì)量和穩(wěn)定性。該法最早由Lerner等［10］于1987年首次報(bào)道，國(guó)內(nèi)最早則由徐小珂等［11］于1996年報(bào)道，但二者培養(yǎng)液中均含強(qiáng)有絲分裂促進(jìn)劑佛波酯，不排除有致癌的危險(xiǎn)性［9］。朱美財(cái)?shù)龋?］研究中所用的 M2培養(yǎng)液為含重組bFGF的DMEM／F12，成分固定不易調(diào)整。而本研 究 與 Hong 等［4，7－8，12］研 究 均 使 用 Hu16 培 養(yǎng)液，其添加物質(zhì)主要為bFGF、IBMX和胎牛血清，無(wú)致突變成分，且在培養(yǎng)過(guò)程中可根據(jù)黑素細(xì)胞的生長(zhǎng)情況和產(chǎn)黑素能力調(diào)整培養(yǎng)液中成分用量，使體外培養(yǎng)的黑素細(xì)胞狀態(tài)達(dá)到最佳。徐小珂等［11］報(bào)道的方法為：一次取材可復(fù)色25cm2，對(duì)于白斑皮損面積大的患者則需多次取材。而使用Hu16培養(yǎng)液培養(yǎng)的黑素細(xì)胞可傳至10余代仍保持良好的增殖能力，每次移植時(shí)留取1／5細(xì)胞繼續(xù)傳代，該法具有一次取材、多次移植的優(yōu)勢(shì)，可減少患者多次取皮的痛苦。本研究結(jié)果顯示：自體黑素細(xì)胞體外培養(yǎng)移植治療白癜風(fēng)技術(shù)具有見效快、復(fù)色均勻等優(yōu)勢(shì)，值得臨床推廣。

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R758.41

B

1671－587Ⅹ（2012）06－1187－04

2012－03－13

吉林省產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究與開發(fā)專項(xiàng)項(xiàng)目資助課題 （3J110J403428）；吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目資助課題（20080740）

姚 蕾 （1983－），女，黑龍江省大慶市人，醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，主要從事白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)理及治療的研究。

李珊山 （Tel：0431－88782615，E－mail：shansalee＠163.com）