陶 冶，張小卿，吳 瓊，吳景東

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)教研室，遼寧 沈陽110847；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院針灸教研室，遼寧 沈陽110847；3.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院小兒神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽110004；4.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)生工作處，遼寧 沈陽110847）

絞股藍總皂苷對光老化HaCaT細胞中p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表達的抑制作用

陶 冶1，張小卿2，吳 瓊3，吳景東4

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)教研室，遼寧 沈陽110847；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院針灸教研室，遼寧 沈陽110847；3.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院小兒神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽110004；4.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)生工作處，遼寧 沈陽110847）

目的：觀察絞股藍總皂苷含藥血清對光老化HaCaT細胞p38促分裂原活化蛋白激酶 （p38MAPK）蛋白和Jun基因 （c－Jun）mRNA表達的影響，探討絞股藍總皂苷含藥血清抗皮膚光老化的作用機制。方法：采用中波紫外線 （UVB）照射建立光老化HaCaT細胞模型，加低、中、高劑量絞股藍總皂苷含藥血清于光老化HaCaT細胞模型培養(yǎng)液中培養(yǎng)，并設(shè)空白對照組、空白血清組和UVB模型組。采用Western blotting和RTPCR方法檢測各組細胞p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA的表達水平。結(jié)果：與空白對照組比較，UVB模型組細胞p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表達顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.01）；與UVB模型組比較，低、中和高劑量含藥血清組細胞p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表達顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.01）；與空白血清組比較，低、中和高劑量含藥血清組細胞p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表達下降 （P＜0.01）。結(jié)論：絞股藍總皂苷含藥血清可能通過抑制p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表達抑制皮膚光老化。

光老化；絞股藍總皂苷；角質(zhì)形成細胞；中波紫外線；p38促分裂原活化蛋白激酶；Jun基因

反復(fù)的日光照射會導(dǎo)致皮膚光老化，引發(fā)皮膚干燥、色素增加、松弛和皺紋形成等皮膚改變，甚至?xí)l(fā)皮膚良性和惡性腫瘤。皮膚光老化的分子機制主要為膠原蛋白降解增加和合成減少，應(yīng)用中藥提取物抑制皮膚光老化是近些年來研究的熱點［1－2］。角質(zhì)細胞是光老化過程中涉及的主要細胞類型之一。有關(guān)絞股藍總皂苷抗皮膚光老化的作用機制目前國內(nèi)外尚無相關(guān)報道。本研究應(yīng)用絞股藍總皂苷含藥血清體外干預(yù)中波紫外線 （UVB）照射的具有與人皮膚角質(zhì)細胞分化特性高度相似的人永生化皮膚角質(zhì)形成細胞株 （HaCaT）細胞，探討絞股藍總皂苷抑制皮膚光老化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細胞、試劑及儀器 20只雄性SD大鼠 （SPF級）購自中國醫(yī)科大學(xué)，體質(zhì)量200～250g，合格證號SCXK （遼）2008－0005；HaCaT細胞 （上海艾研生物科技有限公司）；絞股藍總皂苷 （MUST－11031401，成都曼斯特生物科技有限公司），兔抗人p38促分裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）抗體 （bs－0637R，購自北京博奧森生物科技有限公司），RT－PCR 試劑盒（DRR014A，購自大連寶生物工程有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱 （HH·B11·500型，上海躍進醫(yī)療器械廠），凝膠成像分析系統(tǒng) （Chemi Imager 5500型，美國Alphainnotech chemi Imager公司），垂直板電泳裝置 （Mini－ProteinⅢ型，美國BIORAD公司），UVB光源 （20W，南京華強電子有限公司）。

1.2 動物分組及給藥 20只大鼠隨機分為正常對照組、絞股藍低劑量組、絞股藍中劑量組和絞股藍高劑量組，每組5只。成人絞股藍服藥量約為30g·d－1，絞股藍總皂苷提取體積分數(shù)為3%，根據(jù)Meeh－Rubner公式換算，200g體質(zhì)量大鼠每天給藥量約為0.016g，即絞股藍低劑量組大鼠給藥劑量約為80mg·kg－1·d－1；絞股藍中劑量組約為160mg·kg－1·d－1；絞股藍高劑量組約為320mg·kg－1·d－1。正常對照組大鼠不予灌胃。取絞股藍總皂苷充分溶于生理鹽水后給大鼠灌胃，每日灌胃1次，共灌胃7d，第7天正常灌胃1h后，經(jīng)大鼠腹主動脈取血，置于促凝管內(nèi)，室溫靜置1h，2 000r·min－1離心10min，收集上清，56℃水浴滅活30min，0.22μm濾膜過濾，置于5mL離心管，凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 光老化HaCaT細胞模型的建立 HaCaT細胞于37℃、5%CO2，10%胎牛血清 （FBS）、雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基條件下正常培養(yǎng)。參照文獻［3－4］及預(yù)實驗結(jié)果，取對數(shù)生長期的細胞消化成單細胞懸液，以細胞密度1×104mL－1接種于一新培養(yǎng)瓶，每瓶5mL，共接種60瓶，培養(yǎng)24h。隨機抽取其中10瓶細胞，設(shè)為空白對照組，不進行UVB照射和絞股藍總皂苷含藥血清干預(yù)，正常培養(yǎng)。其余50瓶細胞，隨機分為UVB模型組、空白血清組、低劑量含藥血清組、中劑量含藥血清組和高劑量含藥血清組，每組10瓶，分別棄去培養(yǎng)液，加入適量PBS反復(fù)洗至無色后加入2mL PBS，放在UVB燈下照射，根據(jù)公式 （UVB劑量＝UVB輻照強度×?xí)r間）計算照射劑量為35mJ·cm－2，燈源和培養(yǎng)瓶間距15cm。UVB模型組細胞經(jīng)照射后，棄去PBS，加入5mL新鮮培養(yǎng)液，正常培養(yǎng)；空白血清組細胞經(jīng)照射后，棄去PBS，加入5mL含10%正常對照組大鼠血清的新鮮培養(yǎng)液，正常培養(yǎng)；低、中、高劑量含藥血清組細胞照射后，棄去PBS，分別加入5mL含10%低、中和高劑量組大鼠血清的新鮮培養(yǎng)液，正常培養(yǎng)；12h后，檢測6組細胞p38MAPK蛋白表達量和c－Jun mRNA表達量。

1.4 Western blotting法檢測各組細胞p38MAPK蛋白表達量 以上6組細胞，每組隨機抽取5瓶，采用Western blotting法對細胞中p38MAPK蛋白的表達水平進行檢測。收集細胞，應(yīng)用Western blotting及IP細胞裂解緩沖液于冰上提取總蛋白，BCA法測定各組蛋白含量，調(diào)整含量為2 000mg·L－1，40μg蛋白上樣，電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1h，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1h。暗室內(nèi)ECL發(fā)光，X光膠片曝光，采集照片，分析結(jié)果，以目的條帶積分光密度值／內(nèi)參條帶積分光密度值的比值表示p38mAPK蛋白表達量。

1.5 RT－PCR法檢測各組細胞中c－Jun mRNA 表達水平 采用RT－PCR法對各組剩余的5瓶細胞中c－Jun mRNA的表達水平進行檢測。內(nèi)參GAPDH的上游引物序列為5′－GTC AGT GGT GGA CCT GAC CT－3′，下游引物序列為5′－AGG GGT CTA CAT GGC AAC TG－3′，擴增片段長度為420bp；目的基因c－Jun上游引物序列為5′－AGA ATC CGA AGG GAA AGG AA－3′，下游引物序列為5′－CTT CTC CTT CAG CAG GTT GG－3′，擴增片段長度為221bp。收集細胞，應(yīng)用Trizol提取細胞中總RNA，然后將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再利用引物對其進行擴增，擴增后的產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，電泳結(jié)束后在凝膠成像分析系統(tǒng)中進行觀察，并采集照片，對各條帶的積分光密度值進行測定，最后以每個樣本的目的條帶與內(nèi)參條帶的積分光密度值之比表示c－Jun mRNA表達水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 10.0軟件包對各組數(shù)據(jù)進行分析。p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表達量以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

各組細胞p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表達量：空白對照組細胞p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表達處于低水平；與空白對照組比較，UVB模型組細胞p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表達顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.01）；與UVB模型組比較，低、中和高劑量含藥血清組細胞p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表達顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.01）；與空白血清組比較，低、中和高劑量含藥血清組細胞p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表達顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.01）；隨著絞股藍總皂苷含藥血清含量的增加，低、中和高劑量含藥血清組細胞p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表達逐漸下調(diào)，各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 （均P＜0.05）。見表1、圖1和2。

表1 各組細胞中p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表達水平Tab.1 Eexpressions levels of p38MAPK protein and c－Jun mRNA of cells in various groups （n＝5，±s）

表1 各組細胞中p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表達水平Tab.1 Eexpressions levels of p38MAPK protein and c－Jun mRNA of cells in various groups （n＝5，±s）

＊ P＜0.01 vs blank control group；△P＜0.01 vs UVB model group；＃P＜0.01 vs blank serum group.

Group Expression of p38MAPK protein Expression of c－Jun mRNA Blank control 0.279±0.016 0.257±0.029 UVB model 0.832±0.062＊ 0.813±0.044＊Blank serum 0.799±0.056＊ 0.732±0.039＊Low dose of gypenosides－containing serum 0.550±0.031＊△＃ 0.620±0.023＊△＃Middle dose of gypenosides－containing serum 0.440±0.022＊△＃ 0.555±0.035＊△＃High dose of gypenosides－containing serum 0.378±0.022＊△＃ 0.500±0.022＊△＃

圖1 各組細胞中p38MAPK蛋白表達電泳圖Fig.1 Electrophoregram of expressions of p38MAPK protein of cells in various groupsLane 1：Blank control group；Lane 2：UVB model group；Lane 3：Blank serum group；Lane 4－6：Low，middle，and high doses of gypenosides－containing serum groups.

圖2 各組細胞中c－Jun mRNA表達電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expression of c－Jun mRNA of cells in various groupsM：Marker；Lane 1：Blank control group；Lane 2：UVB model group；Lane 3：Blank serum group；Lane 4－6：Low，middle，and high doses of gypenosides－containing serum groups.

3 討 論

絞股藍為葫蘆科植物絞股藍的全草，具有清熱解毒、益氣養(yǎng)陰及生津安神的功效。體內(nèi)實驗研究［5］表明：絞股藍提取液可以延緩皮膚光老化動物的皮膚衰老?，F(xiàn)代研究［6］表明：絞股藍除含有糖類、黃酮、氨基酸、甾醇和維生素C等微量元素外，主要成分為絞股藍總皂苷，具有抗衰老、抗疲勞和抗缺氧等廣泛功效。研究［7］表明：紫外線照射皮膚光老化分子機制為紫外線輻射皮膚表皮角質(zhì)形成細胞和真皮成纖維細胞，角質(zhì)細胞是UVB輻射的主要目標，表皮生長因子受體和有關(guān)細胞因子受體通過一系列上游激酶的活化激活絲裂原活化蛋白激酶 （MAPK），上調(diào)c－Jun的表達，增高的c－Jun和組成型表達的c－Fos結(jié)合成轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白－1（AP－1），刺激基質(zhì)金屬蛋白酶 （MMPs）的基因轉(zhuǎn)錄，進一步特異性降解幾乎所有的細胞外基質(zhì)。p38MAPK屬于MAPK家族 （細胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK，c－Jun N端激酶JNK和p38MAPK）成員，主要被紫外線輻射所激活［8－9］。p38MAPK 通路被激活后，可以激活其下游信號分子NF－κB和AP－1 （c－Jun，c－Fos），刺激 MMPs的轉(zhuǎn)錄［10］。本研究針對MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的關(guān)鍵蛋白p38MAPK和基因c－Jun mRNA表達水平進行研究，結(jié)果表明：經(jīng)UVB照射后的HaCaT細胞內(nèi)p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表達水平顯著上升。本文作者認為：UVB可能是通過激活HaCaT細胞內(nèi)的MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而實現(xiàn)其對細胞的光損傷作用，這一結(jié)果與以往研究［3，11］基本一致。有研究［3］表明：UVB誘導(dǎo)的HaCaT細胞中，石榴提取物 （POMx）能抑制UVB MAPK表達的上調(diào)和c－Jun的磷酸化從而防止皮膚光老化；楊梅黃酮可以抑制UVB輻射誘發(fā)的p38MAPK上調(diào)抑制皮膚光老化；山柰酚可以抑制p38MAPK蛋白和JNK表達，保護皮膚光老化。

另外，本研究采用不同劑量的絞股藍總皂苷對大鼠進行灌胃，連續(xù)7次，然后采集末次給藥后1h的大鼠含藥血清用于實驗。絞股藍總皂苷的原有成分進入機體所產(chǎn)生的藥理作用機制十分復(fù)雜，研究［11］表明：其在體內(nèi)可能會轉(zhuǎn)化為活性成分，或者代謝后失去活性，或者其本身并無作用但經(jīng)代謝后而產(chǎn)生作用，或者通過第二信使間接起作用。因此本研究方法更接近藥物在體內(nèi)產(chǎn)生藥理效應(yīng)的真實過程，理論上更具科學(xué)性和真實性。

含藥血清干預(yù)結(jié)果表明：與UVB模型組比較，絞股藍總皂苷含藥血清各組p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA的表達量降低，隨著絞股藍總皂苷含藥血清含量的增高，其下調(diào)作用明顯加強，成劑量－效應(yīng)依賴；空白血清組的p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表達水平盡管有所下調(diào)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究提示：空白大鼠血清對光老化模型HaCaT細胞的作用可能來自于血清對細胞的營養(yǎng)作用，但作用甚微；而不同劑量絞股藍總皂苷含藥血清對光老化模型HaCaT細胞內(nèi)p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA的表達水平呈現(xiàn)明顯的抑制作用，并呈量－效依賴，由此提示：絞股藍總皂苷在體內(nèi)經(jīng)過代謝可產(chǎn)生明顯的抑制p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表達的作用，該作用可能是絞股藍總皂苷能夠抵抗紫外線損傷作用的關(guān)鍵機制之一。但絞股藍總皂苷對于MAPK家族其他信號分子的作用影響尚未作詳細研究，有待進一步探討。

綜上所述，絞股藍總皂苷含藥血清可以抑制UVB照射HaCaT細胞誘導(dǎo)的p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表達水平增高，并成良好的劑量－效應(yīng)關(guān)系。絞股藍總皂苷含藥血清可能通過抑制p38MAPK蛋白和c－Jun mRNA表達抑制皮膚光老化。

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Inhibitory effect of gypenosides on expressions of p38MAPK protein and c－Jun mRNA in photoaging HaCaT cells

TAO Ye1，ZHANG Xiao－qing2，WU Qiong3，WU Jing－dong4
（1.Department of Basic Theory of Traditional Chinese Medicine，School of Basic Medical Sciences，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China；2.Department of Acupuncture，School of Acupuncture and Massage，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China；3.Department of Pediatrics Neurology，Affiliated Shengjing Hospital，China Medical University，Shengang 110004，China；4.Student Affair Office，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，China）

ObjectiveTo observe the effect of gypenosides－containing serum on the expressions of p38mitogenactivated protein kinase （p38MAPK）protein and c－Jun mRNA in photoaging HaCaT cells and to explore the mechanism of inhibitory effect of gypenosides－containing serum on photoaging.MethodsThe photoaging HaCaT cell model was established by UVB radiation，low，middle，and high doses of gypenosides－containing serum were used in the culture fluid of phatoaging HaCaT cell models；meanwhile blank control group，blank serum group and UVB model group were set up.The expression levels of p38MAPK protein and c－Jun mRNA of cells in each group were measured by Western blotting and RT－PCR methods.ResultsCompared with blank control group，the expression levels of p38MAPK protein and c－Jun mRNA of the cells in UVB model group were significantly increased，the difference had statistical significance（P＜0.01）.Compared with UVB model group，the expression levels of p38MAPK protein and c－Jun mRNA of cells in low，middle and high doses of gypenosides－containing serum groups were significantly decreased，the difference had statistical significance （P＜0.01）.Compared with blank serum group，the expression levels of p38MAPK protein and c－Jun mRNA of the cells in low，middle and high doses of gypensides－containing serum groups were decreased （P＜0.01）.ConclusionGypenosides－containing serum could prevent the skin photoaging by inhibinting the expressions of p38MAPK protein and c－Jun mRNA.

photoaing；gypenosides；HaCaT；ultraviolet B；p38MAPK；c－Jun

R758.14

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1147－05

2012－06－04

遼寧省科技廳自然科學(xué)基金資助課題 （20102149）

陶 冶 （1984－），女，遼寧省丹東市人，在讀醫(yī)學(xué)博士，主要從事中醫(yī)美容學(xué)方面的研究。

吳景東 （Tel：024－31207258，E－mail：lnzywjd0719＠163.com）