許 忠，張 磊，鄭百紅，茍偉會，徐曉恒，車廣華，田 昕

（吉林大學第二醫(yī)院兒科，吉林 長春130041）

轉染神經(jīng)生長因子基因的腹腔移植微囊化細胞對缺氧缺血性腦病新生大鼠腦損傷的保護作用

許 忠，張 磊，鄭百紅，茍偉會，徐曉恒，車廣華，田 昕

（吉林大學第二醫(yī)院兒科，吉林 長春130041）

目的：探討腹腔移植微囊化神經(jīng)生長因子 （NGF）基因3T3細胞對缺氧缺血性腦病 （HIBD）新生大鼠腦損傷的保護作用，為尋找治療新生兒HIBD的有效方法提供實驗依據(jù)。方法：新生Wistar大鼠60只，隨機分為假手術組、空囊組和移植組，每組20只。假手術組大鼠腹腔注射生理鹽水，空囊組大鼠制備HIBD模型后腹腔注射空微囊，移植組大鼠制備HIBD模型后腹腔注射微囊化3T3細胞。分別觀察各組新生鼠腦組織水含量和海馬區(qū)陽性細胞凋亡率。結果：空囊組和移植組大鼠存在不同程度腦水腫，空囊組大鼠腦組織含水量高于假手術組 （P＜0.05），移植組大鼠腦組織含水量與假手術組比較差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05），但低于空囊組（P＜0.05）。TUNLE免疫組織化學，空囊組與假手術組比較細胞凋亡率差異具有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05），移植組陽性細胞凋亡率低于空囊組 （P＜0.05）。結論：腹腔移植微囊化NGF基因3T3細胞可以減輕大鼠HIBD后腦水腫，且對大鼠HIBD后海馬神經(jīng)元有保護作用。

微囊；神經(jīng)生長因子；新生鼠；缺氧缺血性腦?。荒X水腫；細胞凋亡

缺 氧 缺 血 性 腦 病 （hypoxic－ischemic brain damage，HIBD）是由多種圍生期因素所致的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病，常留有嚴重神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，25%以上的患兒遺留永久的神經(jīng)心理缺陷，如腦癱、精神發(fā)育障礙、學習困難和癲癇［1］。HIBD的發(fā)生機制復雜，涉及能量代謝、細胞內(nèi)鈣離子超載、興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性、一氧化氮和缺血再灌注時氧自由基的損傷以及由此導致的神經(jīng)細胞凋亡［2］。目前公認神經(jīng)生長因子 （nerve growing factor，NGF）對神經(jīng)元有營養(yǎng)作用，可促進受損神經(jīng)元再生，對缺血缺氧的神經(jīng)具有重要保護作用和修復作用［3］。由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的特殊組織結構限制了NGF的應用，國內(nèi)外報道NGF多采用顱內(nèi)給藥的方式，其缺點是給藥量受限、損傷大，因此外周合適的給藥途徑是目前研究的熱點。本實驗旨在利用免疫隔離技術持續(xù)外周給予大鼠NGF，探討NGF對HIBD新生大鼠腦組織的保護作用，為NGF臨床治療HIBD提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑 出生后7dWistar大鼠共60只，體質(zhì)量12～18g，雌雄各半。TUNEL試劑盒由上海蘭基生物科技有限公司提供。

1.2 表達NGF基因細胞的構建、微囊化及培養(yǎng)

轉染NGF的3T3細胞購自中科院大連化學物理研究所生物醫(yī)用材料工程組，參照該實驗室的方法［4］制備海藻酸鈉－聚賴氨酸－海藻酸鈉 （alginatepoly－l－lysne－alginate，APA）膠囊，將轉染 NGF的3T3細胞微囊化并進行體外培養(yǎng)。

1.3 細胞活化性和功能檢測將培養(yǎng)后的微囊化細胞洗去培養(yǎng)液，用0.01%丫啶橙生理鹽水溶液孵育5min，PBS沖洗，利用激光掃描共聚焦顯微鏡 （confocal laser scanning microscopy，CLSM ）（氣冷式氪－氬離子混和激光管，激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長500～530／560～620nm）觀察，采用ELISA法測定微囊化轉染3T3細胞分泌的NGF含量，嚴格按照說明書操作［5］（以上過程在大連化學物理研究所生物醫(yī)用材料工程組內(nèi)完成）。

1.4 動物模型的制備 新生鼠水合氯醛腹腔麻醉后，仰臥固定于手術板上，乙醇局部消毒，頸部正中切口，游離右頸總動脈，0號線結扎，6－0線一次性縫線縫合頸部正中切口，即將缺血后新生鼠置入自制常壓缺氧艙。缺氧艙大小為50cm×50cm×60cm，留有2個2cm×2cm小孔與外界相通，艙內(nèi)有電熱毯控制艙溫，鈉石灰吸收艙內(nèi)水分和CO2。將手術后新生大鼠置于由氮氣和空氣調(diào)節(jié)、測氧儀監(jiān)控的常壓缺氧艙內(nèi) ［艙溫 （36±1）℃，氧濃度0.08%］，2h后取出［5］。模型成功判定標準：新生大鼠在缺氧開始后30～60min均出現(xiàn)皮膚青紫、搖頭、肢體抖動、前爪拍頭、抽搐和昏迷等表現(xiàn)則認為造模成功，納入實驗。假手術組大鼠作頸部正中切口，游離右頸總動脈，不結扎該動脈，6－0線一次性縫線縫合頸部正中切口，不置入缺氧倉。

1.5 動物分組及給藥 60只大鼠隨機分成假手術組、空囊組和移植組，每組20只。假手術組大鼠：腹腔注射生理鹽水；空囊組大鼠：制備缺氧模型，腹腔注射空微囊；移植組大鼠：制備缺氧模型，腹腔注射微囊化3T3細胞?？漳医M和移植組大鼠出艙后30min分別給予腹腔注射空微囊、微囊化3T3細胞，每只0.3mL。

1.6 動物灌注固定及腦標本制備 3組大鼠上述處理后分籠常規(guī)飼養(yǎng)，手術后7d應用10%水合氯醛每只0.2mL麻醉各組剩余10只新生大鼠，將大鼠四肢固定于手術板上，切開胸腔后暴露心臟，以穿刺針穿至左心室，并切開右心房，以0.9%生理鹽水灌洗，至灌流出液體清亮為止，然后以4%多聚甲醛液灌注，3～5min后新生大鼠出現(xiàn)四肢抖動、強直、頭向后仰和似角弓反張樣，迅速斷頭取腦。將腦組織置于4%多聚甲醛溶液中固定2周。取出固定后的腦組織，以視交叉、乳頭體中部、大腦后緣與小腦連接處為切點，將腦冠狀切成4片，常規(guī)石蠟包埋，選取杏仁裂冠狀切面進行切片（5μm），取額葉皮質(zhì)和海馬區(qū)同一部位的連續(xù)切片，編號后置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。各組標本取海馬CA1區(qū)相同部位石蠟切片1張，進行蘇木精－伊紅染色。在200倍光鏡下觀察普通染色下腦組織病理表現(xiàn)。

1.7 腦組織含水量測定 各組中隨機取10只新生大鼠，斷頭取腦，分析天平稱質(zhì)量，80℃烘干至恒質(zhì)量時稱干質(zhì)量。計算腦組織含水量＝ （濕質(zhì)量－干質(zhì)量）／濕質(zhì)量×100%。

1.8 細胞凋亡率的測定 采用標準TUNLE制作方法。各組標本取海馬同部位組織切片，常規(guī)脫蠟至水。蒸餾水洗滌2min×3次。標本切片加1∶200新鮮稀釋蛋白酶于37℃消化10min。0.1mol·L－1TBS洗2min×3次。每個標本片加標記緩沖液20μL，以保持切片濕潤。按每片取TDT和地高辛的dUTP各1μL，加入標記緩沖液中搖勻。甩去切片上多余液體后加標記液20μL至樣品濕盒中，37.0℃標記2h。0.1mol·L－1TBS洗2min×3次。加封閉液50μL，室溫30min，甩掉封閉液。生物素化抗地高辛抗體50μL，加至標本片上，置樣品于濕盒中，37.0℃、30min。0.1mol·L－1TBS洗2min×3次。取1mL 0.1mol·L－1TBS加鏈霉親和素－過氧化物酶 （SABC）10μL，混勻后加至切片。37.0℃、30min。0.1mol·L－1TBS洗5min×4次。取1mL蒸餾水分別加入DAB試劑盒中，A、B、C試劑各1滴加至標本片上，顯色10～30min，水洗。蘇木素復染，0.1mol·L－1TBS和蒸餾水沖洗，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。以不含Bio－dUTP的TDT反應液做陰性對照，檢測TUNLE的特異性。細胞凋亡率＝凋亡陽性細胞／總細胞數(shù)×100%。每張切片分別測5個視野，取平均值。

1.9 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析。腦組織含水量和凋亡細胞數(shù)量以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間比較采用q檢驗。

2 結 果

2.1 各組新生大鼠腦組織含水量的比較 空囊組大鼠腦組織含水量高于假手術組 （P＜0.05），移植組腦組織含水量與假手術組比較差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05），但低于空囊組，差異具有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）。見表1。

2.2 TUNEL法檢測凋亡陽性細胞 TUNEL染色后光鏡下可見凋亡陽性細胞改變，缺血缺氧（HI）后海馬CA1區(qū)可見較多凋亡細胞，空囊組與假手術組海馬CA1區(qū)細胞凋亡率比較差異具有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）。200倍光鏡下見細胞染為核棕色即為陽性凋亡細胞，提示新生大鼠HI后神經(jīng)細胞有凋亡發(fā)生；移植組TUNEL染色陽性細胞百分數(shù)低于空囊組，差異具有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）。見表1和圖1（插頁二）。?

表1 新生大鼠HI后7d腦組織含水量及細胞凋亡率比較Tab.1 Comparisons of water contents in brain tissue and apoptotic rates of new－born rats 7dafter HI（n＝10，±s，η／%）

表1 新生大鼠HI后7d腦組織含水量及細胞凋亡率比較Tab.1 Comparisons of water contents in brain tissue and apoptotic rates of new－born rats 7dafter HI（n＝10，±s，η／%）

＊P＜0.05compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with blank capsule group.

totic rate Sham op Group Water content Apop eration 80.75±1.70 3.2±1.6 Blank capsule 86.28±2.61 49.6±2.7 Transplant 80.27±0.97＊△ 30.2±2.2＊△

3 討 論

NGF是神經(jīng)系統(tǒng)最重要的生物活性因子之一，具有維持交感神經(jīng)和感覺神經(jīng)細胞功能、促進神經(jīng)細胞分化、決定軸突生長方向、促進周圍神經(jīng)再生、促進損傷的中樞神經(jīng)和外周神經(jīng)修復、維持生存和誘導突起生長的作用［6－7］。NGF對中樞神經(jīng)的保護作用已成為目前研究的熱點。目前中樞神經(jīng)系統(tǒng)的NGF臨床應用存在很多限制，如NGF為蛋白質(zhì)，不適合經(jīng)過消化道口服途徑給藥；NGF半衰期短，需要反復、多次給藥；中樞系統(tǒng)局部給藥空間小，損傷大。黃英等［8］已證實：NGF可以透過HIBD新生鼠的血腦屏障，為外周治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷提供了有力的依據(jù)。APA微囊除具有穩(wěn)定性外，本身無免疫原性，具有良好的生物相容性［9］，可將宿主體內(nèi)對微囊內(nèi)組織細胞產(chǎn)生的免疫活性物質(zhì)阻隔在微膠囊外，從而減輕宿主對移植物的免疫排斥反應，同時允許細胞生存所需營養(yǎng)物質(zhì)以及細胞分泌的活性物質(zhì)進入和擴散出微囊。

腦水腫為HIBD主要的病理改變，尤以額葉白質(zhì)區(qū)、海馬區(qū)對腦水腫最敏感［10］。腦組織HI可引起瀑布式連鎖反應，加重腦水腫。腦組織含水量是反映腦水腫的重要指標，本研究發(fā)現(xiàn)移植組大鼠腦組織含水量與假手術組比較差異無統(tǒng)計學意義，但低于空囊組，表明NGF治療后可能減輕HIBD后腦水腫的程度。

HIBD是新生兒死亡和嬰幼兒神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的主要原因，HIBD發(fā)生的原因主要是腦缺血－再灌注損傷，包括缺血期原發(fā)損傷和再灌注后的繼發(fā)損傷。近年來許多研究［11］表明：全腦或局部腦缺血引起神經(jīng)元死亡以凋亡為主。各種動物實驗［12］表明：腦損傷后4～6h細胞凋亡即開始出現(xiàn)，凋亡高峰出現(xiàn)在損傷后48～72h。遲發(fā)性腦細胞凋亡是加重腦損傷的一個因素。因此，尋求抑制神經(jīng)細胞凋亡的干預措施將成為HIBD治療的轉折點。本實驗結果顯示：移植組大鼠染色陽性細胞低于空囊組，表明應用腹腔注射微囊化3T3細胞產(chǎn)生的NGF可減輕腦細胞的凋亡進而減輕腦損傷，起到保護腦組織的作用。移植組大鼠海馬CA1區(qū)凋亡陽性細胞高于假手術組，表明應用腹腔注射微囊化3T3細胞的NGF治療可減輕凋亡的程度，但是并不能完全阻止HIBD后凋亡的級聯(lián)反應。NGF通過抑制毒性氨基酸的釋放，抑制鈣離子的超載，抑制超氧自由基的釋放，抑制細胞凋亡，防止和減輕繼發(fā)的損害［13］。刁士元［14］認為：外源性NGF明顯減少了腦缺血－再灌注后細胞凋亡的發(fā)生，減輕神經(jīng)系統(tǒng)損傷，對受損神經(jīng)元起到全面而持久的保護作用。

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Protective effect of celiac transplanting micro－capsulated cells transfected by nerve growing factor gene on hypoxic－ischemic brain damage in new－born rats

XU Zhong，ZHANG Lei，ZHENG Bai－h(huán)ong，GOU Wei－h(huán)ui，XU Xiao－h(huán)eng，CHE Guang－h(huán)ua，TIAN Xin
（Department of Pediatrics，Second Hospital，Jilin University，Changchun 130041，China）

ObjectiveTo discuss the protective effect of celiac transplanting micro－capsulated 3T3cells transfected by nerve growing factor（NGF）gene on hypoxic－ischemic brain damage （HIBD）in new－born rats，and to provide experimental basis for HIBD treatment.Methods60new－born Wistar rat，were randomly divided into sham operation group（n＝20），blank capsule group （n＝20），and transplant group （n＝20）.The rats in sham operation group were injected with saline.The rat models of HIBD were set up and used in blank capsule group and transplant group.The rats in blank capsule group were transplanted with blank capsules.The rats in transplant group were treated by transplanting micro－capsulated 3T3cells transfected by NGF gene.The changes of water contents and the apoptotic rates of rat neuron in each group were analyzed.ResultsThe rats in blank caspsule and transplant groups had various degrees of hydrocephalus，the water content in brain tissues of rats in blank capsule group was higher than that in sham operation group （P＜0.05）.The water content in brain tissues of rats in transplant group had no significant difference compared with sham operation group （P＞0.05），but it was lower than that in blank capsule group （P＜0.05）.The TUNLE immunohistochemistry results showed that there was significant difference of apoptotic rate of neuron between blank capsule group and sham operation group（P＜0.05），and the apoptotic rate of rat neuron in transplant group was lower than that in blank capsule group （P＜0.05）.ConclusionCeliac transplanting of micro－capsulated NGF 3T3cells can relieve the hydrocephalus after HIBD and protect the hippocampal neuron after HIBD.

micro－capsulate；nerve growing factor；new－born rats；hypoxic－ischemic brain damage；hydrocephalus；apoptosis

R743.31

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1110－04

2011－07－15

吉林省科技廳科研基金資助課題 （20070426－2）

許 忠 （1959－），男，吉林省敦化市人，教授，醫(yī)學碩士，主要從事小兒神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面的研究。

茍偉會 （Tel：0431－88796802，E－mail：gouweihui＠163.com）