耿 仙 馮承保 吳建民 楊會茹 宋新梅

（1 河北大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥理教研室，保定071002；2 河北省保定市第二醫(yī)院腫瘤科，保定071000；3 河北省新樂市醫(yī)院外科，新樂050700；4 河北省新樂市醫(yī)院兒科，新樂050700）

DNA重組標(biāo)記技術(shù)的成功是因為標(biāo)記并不改變被標(biāo)記蛋白的功能，特別有兩大進展使得標(biāo)記技術(shù)切實可行：通過合成寡核苷酸和PCR技術(shù)將標(biāo)記物插入到蛋白表達載體中；在病毒、細菌、植物、酵母、昆蟲和哺乳動物細胞系統(tǒng)中可表達重組標(biāo)記蛋白。FLAG標(biāo)記物是唯一專為標(biāo)記目的設(shè)計的多肽標(biāo)記物[1]，其特點是標(biāo)記物的序列不是來自任何已知的蛋白。該標(biāo)記物是由8個氨基酸殘基組成的多肽，具有親水性，可置于蛋白的氨基或羧基末端。多種FLAG標(biāo)記蛋白可保留全部的生化活性（如轉(zhuǎn)錄因子、生長因子和酶），這些標(biāo)記物亦廣泛應(yīng)用于細胞染色、免疫印跡和免疫沉淀試驗中。本實驗采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，將 FLAG標(biāo)記物插入到GIRK4通道的氨基端，通過與蛋白表達載體的連接，表達于爪蟾卵母細胞，使之轉(zhuǎn)錄翻譯出帶有抗原表位標(biāo)記的GIRK4通道蛋白，為接下來的免疫印跡、免疫沉淀試驗做好充分準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 材料 試劑：GIRK4的cDNA由美國紐約大學(xué)西奈山醫(yī)學(xué)院Diomedes Logothetis教授惠贈。

1.2 實驗動物 實驗選用非洲爪蟾（Xenopus laevis）購自中科院上海神經(jīng)科學(xué)研究所。

1.3 方法

1.3.1 構(gòu)建重組質(zhì)粒DNA 設(shè)計引物。將FLAG標(biāo)記短肽的氨基酸序列所對應(yīng)的 DNA堿基序列插入到GIRK4-pGEMHE的DNA堿基序列的上游，設(shè)計好的引物如下：

上游：5’TCT CCC GGG ATG GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG ATG GCT GGC GAT TCT 3’下游：5’CGG AAT TCT CAC ACC GAG CCC C 3’

進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，擴增FLAG-GIRK4 DNA片段，并將其連接至載體pGEMHE質(zhì)粒DNA中，經(jīng)過單克隆鑒定、測序，挑取無堿基突變的克隆，重組質(zhì)粒DNA構(gòu)建成功。

重組FLAG-GIRK4通道及GIRK4通道蛋白表達于爪蟾卵母細胞，使用雙電極電壓鉗方法記錄通道電流，驗證重組FLAG-GIRK4通道電流的正確性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 信號的采集和分析軟件為 pClamp 9.0、Clampfit 9.0，數(shù)據(jù)分析用Origin 7.0完成。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建重組質(zhì)粒DNA 提取pGEMHE載體質(zhì)粒DNA，并使用SmaⅠ 和EcoRⅠ對質(zhì)粒DNA進行雙酶切。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增目的基因片段，得到的產(chǎn)物片段長度與 GIRK4的堿基數(shù)相等，大約為 1300bp，同樣將其用SmaⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切。將PCR擴增產(chǎn)物測序，結(jié)果證實PCR擴增產(chǎn)物為目的產(chǎn)物，非假陽性擴增。將雙酶切后的質(zhì)粒DNA和進行雙酶切后的PCR產(chǎn)物進行連接，連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞，提取重組質(zhì)粒 DNA，通過雙酶切鑒定（Fig.1）、測序，結(jié)果與GIRK4-pGEMHE質(zhì)粒DNA的堿基序列完全相同。重組質(zhì)粒DNA構(gòu)建成功。

2.2 電生理實驗結(jié)果 將由重組質(zhì)粒DNA和GIRK4-pGEMHE質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)錄而來的RNA分別注入卵母細胞，記錄電流。我們首先觀察在高鉀細胞外液（ND96K）中，以從-80mv到+80mv的斜坡電壓記錄到的電流變化，F(xiàn)ig.2A所示為在上述記錄條件下所記錄到的GIRK4電流以及給ACh后的電流變化，F(xiàn)ig.2B所示為重組通道蛋白電流以及給 ACh后的相應(yīng)電流-電壓曲線變化圖，最后用 ND96外液沖洗用以建立零電流基線。Fig.2C、D為以上兩種通道在給 ACh前后電流隨時間變化的結(jié)果。虛線為零電流位置，虛線下曲線為鉗制電壓為-80mv的電流變化，虛線上曲線為鉗制電壓為+80mv的電流變化，結(jié)果顯示10μM ACh能夠明顯增大兩者通道的電流，ACh對兩種通道的激活率比較，無顯著性差異（P＞0.05），見 Fig.2E。這說明所加的FLAG標(biāo)記短肽并未影響GIRK4通道蛋白的表達及其電流特性，為以后研究GIRK4通道蛋白的特性奠定了基礎(chǔ)。

3 討論

采用 DNA重組技術(shù)對蛋白進行標(biāo)記可在各種表達系統(tǒng)中制備和檢測標(biāo)記蛋白，并可通過標(biāo)記物對雜交蛋白進行檢測和純化。該系統(tǒng)的主要影響因素是因在蛋白上引入標(biāo)記物可導(dǎo)致蛋白生物活性改變，因為標(biāo)記的結(jié)果，本質(zhì)上是制造了一個由目的蛋白和標(biāo)記物氨基酸序列融合而成新的蛋白。第二方面的主要影響因素是在進行表位標(biāo)記時，許多目前使用的標(biāo)記物是由已知的蛋白（如myc基因產(chǎn)品）片段組成。這意味著抗標(biāo)記物抗體不僅識別被研究的標(biāo)記蛋白，同時還可能識別其他細胞蛋白。由于GIRK通道N末端起始于細胞內(nèi)，經(jīng)兩次跨膜折疊后C末端結(jié)束于細胞內(nèi)，而且其N末端較短，C末端卻比較長，其C末端對于其在細胞膜的定位與信號傳導(dǎo)有重要的作用。因此我們選擇了在GIRK N末端添加FLAG序列。

本實驗采用的方法為在 PCR引物序列中加入FLAG序列所對應(yīng)的堿基序列，所用PCR循環(huán)數(shù)應(yīng)盡量少，以減少堿基突變的發(fā)生率，還要使用高保真 DNA聚合酶。為了便于克隆，還要在引物的兩端分別加上酶切位點及保護性堿基。為了進一步確認(rèn)連接的正確性，將挑取的多個克隆提取質(zhì)粒DNA，再次使用PCR反應(yīng)所加入的兩個酶對其進行雙酶切鑒定，由于本實驗插入片段為1300bp，因此我們還要通過測序的手段來驗證堿基組成及序列的正確性。兩棲類動物的卵母細胞是生理學(xué)中常用的基因表達系統(tǒng)[2]。卵母細胞能有效的表達外源性mRNA編碼的受體蛋白，進一步將蛋白前體分子加工為成熟蛋白，并最終以正確的方向組裝在卵母細胞表面，形成有功能的受體蛋白，與源組織的天然受體具有相同的生理生化特性[3]。利用這種方式，可以成功的將神經(jīng)系統(tǒng)中難以用普通電生理方法研究的受體和離子通道分子，從胞體較小而且突觸前后相互作用十分復(fù)雜的神經(jīng)元移植到體積較大、情況較為簡單、易培養(yǎng)的卵母細胞中。重組質(zhì)粒 DNA成功表達于爪蟾卵母細胞，用雙電極電壓鉗檢測電流有表達，ACh對帶有FLAG標(biāo)記的重組通道蛋白的激活程度與未帶有 FLAG 標(biāo)記的GIRK4通道蛋白相同。通過在 PCR引物序列中加入FLAG序列所對應(yīng)的 DNA堿基序列，成功構(gòu)建了FLAG-GIRK4重組通道蛋白，為進一步對于GIRK4通道的研究打下了堅實的基礎(chǔ)。

Fig.1 Electrophoresis results of FLAG-GIRK4 DNA identified by SmaⅠand EcoRⅠdouble enzyme digestion.

Fig.2 Effects of ACh on GIRK4 currents and FLAG-GIRK4 currents.

[1]Hopp TP, Pricekitt KS, Price VL, et al. A short polypeptide marker sequence used for recombinant protein identification and purification[J]. Bio Technology, 1988,6:1204-1210

[2]Gurdon JB, Lane CD, Wood HR, et al. Use of frog eggs ang oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells[J]. Nature, 1971,233:177-182.

[3]Dumont JW. Oogenes is in Xenopus laevis (Daudin)Stage of oocyte development in labor atory maintained animals[J]. J Morphol,1972,136:153-180.