吳饒平，熊 偉，歐曉艷，劉 晗，邱淑怡，李桂林，徐昌水，劉雙梅，梁尚棟，高 云

(南昌大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室、2.附屬口腔醫(yī)院預(yù)防科，江西南昌 330006)

三叉神經(jīng)痛(trigeminal neuralgia，TN)是一種病因不明，單側(cè)撕裂性或電擊性陣痛的慢性疼痛綜合癥，臨床上發(fā)病率較高，但治療困難，對(duì)患者及家屬的生活造成極大的痛苦［1－2］。目前雖然治療藥物較多，但有效而副作用小的藥很少，而且容易發(fā)生耐藥［3－4］。因此我們有必要尋找TN治療新的更有效的方法。目前大量研究證實(shí)，ATP及其類似物作用的P2X嘌呤受體在傷害性感受信號(hào)傳遞過(guò)程中起著重要作用［5－8］，其中 P2X2/3受體和痛覺傳遞關(guān)系最為密切，且可能參與三叉神經(jīng)痛的發(fā)生。大黃素(emodin)是中藥大黃的主要有效成分，化學(xué)名為1，3，8-三羥基-6 甲基蒽醌(1，3，8-trihydroxy-6methy lanthraquinone)，分子式為 C15H10O5，分子量為270.23，化學(xué)結(jié)構(gòu)屬于羥基蒽醌類，其藥理作用主要集中在抑制細(xì)胞增殖、抗炎、抑制肝臟和腎臟纖維化等方面。有實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大黃素通過(guò)多種途徑產(chǎn)生抗炎作用［9］。永久性的神經(jīng)病理痛有神經(jīng)炎性及神經(jīng)免疫性作用［10］。所以大黃素可能通過(guò)其抗炎及免疫抑制作用緩解外周神經(jīng)疼痛［11］。目前還不清楚大黃素是否影響慢性疼痛的信息傳遞。ATP是神經(jīng)調(diào)質(zhì)，P2X2/3參與神經(jīng)病理痛中的傷害感受傳導(dǎo)，本研究試圖闡明在P2X2/3受體介導(dǎo)的三叉神經(jīng)痛中，大黃素對(duì)痛覺傳遞的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和分組 ♂ SD大鼠，220～250 g，40只，江西中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供，合格證號(hào):JZDWN2:2011-0316。將大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。Ⅰ組為0.5%羧甲基纖維素鈉溶液注射對(duì)照組(Control)、Ⅱ組為假手術(shù)組(Sham)、Ⅲ組為三叉神經(jīng)痛模型組(TN)、Ⅳ組為TN模型+大黃素干預(yù)組(TN+E)。Ⅰ組每天按5 ml·kg－1劑量腹腔注射0.5%的羧甲基纖維素鈉至實(shí)驗(yàn)結(jié)束;Ⅱ組切開皮膚暴露眶下神經(jīng)，不結(jié)扎神經(jīng)，即縫合皮膚;Ⅳ組術(shù)后d 1開始每天每只大鼠腹腔注射50 mg·kg－1大黃素至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，大黃素用0.5%的羧甲基纖維素鈉溶解。

1.2 藥品和試劑 大黃素(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)，10%水合氯醛(上海新亞藥業(yè)有限公司)，DAB顯色試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)，免疫組化SP-9001試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)，P2X2、P2X3原位雜交試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，P2X2、P2X3抗體(Millipore公司)，β-actin、P2X2、P2X3引物(北京生物工程有限公司)。

1.3 三叉神經(jīng)痛模型的建立 參照文獻(xiàn)［12］10%水合氯醛按4 ml·kg－1劑量對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔內(nèi)注射麻醉。大鼠麻醉后取俯臥位，頭部及四肢固定。備皮、消毒、鋪巾。在手術(shù)顯微鏡下做眉弓上弧形切口，顯露顱骨額骨和鼻骨，暴露眼眶，沿眶上緣將眶內(nèi)容物用神經(jīng)剝離子撥開，暴露位于眶底部?jī)?nèi)側(cè)的眶下神經(jīng)，在眶內(nèi)從近端仔細(xì)分離眶下神經(jīng)至遠(yuǎn)端的眶下孔。用兩根鉻腸線(5-0)間距約2 mm結(jié)扎眶下神經(jīng)，力度適中。壓迫標(biāo)準(zhǔn):在顯微鏡下可見結(jié)扎線使神經(jīng)的直徑略微變細(xì)，但不能完全阻斷其傳導(dǎo)且神經(jīng)外膜的血液循環(huán)必須通暢。縫合創(chuàng)口，待動(dòng)物清醒后給予一般飼養(yǎng)。

1.4 三叉神經(jīng)痛大鼠機(jī)械痛敏測(cè)定 將各組大鼠分別于手術(shù)前 1 d，術(shù)后 1、3、5、7、9、11、13 d 行機(jī)械痛敏閾值測(cè)試(測(cè)定時(shí)間恒定于每日10:00～14:00，室溫維持在22℃ ±0.5℃)。機(jī)械痛敏閾值是由BME-403 Von Frey細(xì)絲(購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所)來(lái)測(cè)定，折力分別為:0.13、0.20、0.33、0.60、1.30、3.60、5.00、7.30、9.90、20.1 g，從最小折力開始，刺激部位為眶下神經(jīng)在面部感覺支配區(qū)域—圍繞鼻區(qū)中央的觸須部位及周圍有毛皮膚。手持刺激棒緩慢接近大鼠，先在手術(shù)的對(duì)側(cè)刺激3下，使細(xì)絲彎曲，再在手術(shù)側(cè)刺激3下，每一強(qiáng)度的細(xì)絲共刺激6次。在此過(guò)程中，細(xì)絲的強(qiáng)度由低到高依次遞增。動(dòng)物的陽(yáng)性反應(yīng)包括:①經(jīng)刺激即表現(xiàn)為快速的后退動(dòng)作，大鼠為避免面部進(jìn)一步被接觸，倦縮身子向籠壁靠攏，或?qū)㈩^面部藏在身下，躲避刺激物。② 攻擊行為，大鼠亦可表現(xiàn)出快速抓咬刺激物，做出攻擊動(dòng)作。③非對(duì)稱性的面部搔抓，表現(xiàn)為至少連續(xù)3次搔抓面部刺激區(qū)域的動(dòng)作，通常合并后退動(dòng)作。出現(xiàn)以上3種反應(yīng)中任意1項(xiàng)或l項(xiàng)以上即認(rèn)為是刺激實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，使大鼠產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)絲強(qiáng)度最小值即為疼痛反應(yīng)閾值。④如果刺激強(qiáng)度為20.1 g時(shí)，大鼠未出現(xiàn)以上任何一種反應(yīng)，疼痛閾值定為20.1 g。觀察各組大鼠手術(shù)前后對(duì)于不同強(qiáng)度細(xì)絲刺激產(chǎn)生痛覺反應(yīng)闞值的變化，與對(duì)照組比較，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5 大鼠三叉神經(jīng)節(jié)P2X2/3受體的表達(dá)測(cè)定

1.5.1 原位雜交 大鼠迅速斷頭，取手術(shù)側(cè)TG，原位雜交用PBS沖洗后用原位雜交用4%多聚甲醛固定24 h，然后浸入原位雜交用30%蔗糖脫水24 h，期間換糖水3次，4℃冰箱過(guò)夜。恒冷切片機(jī)將TG切成15 μm厚的薄片，烤片37℃，2 h，－20℃保存。原位雜交過(guò)程按說(shuō)明書完成。顯微鏡下拍照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Image tool圖像分析系統(tǒng)觀察分析光密度。

1.5.2 RT-PCR 按說(shuō)明書完成總RNA的提取和cDNA的合成。本研究選用β-actin作為內(nèi)參，引物序列如下:

Primer P2X2(產(chǎn)物長(zhǎng)度為273 bp)，S:5'-CTGCCTCCTCAGGCTACAACTTCA-3';A:5'-GAGTACGCACCTTGTCGAACTTCT-3'。Primer P2X3(產(chǎn)物長(zhǎng)度為 519 bp)，S:5'-CAACTTCAGGTTTGCCAAA-3';A:5'-TGAACAGTGAGGGCCTAGAT-3'。Primer β-actin(產(chǎn)物長(zhǎng)度為240 bp)，S:5'-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3';A:5'-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3'。

P2X2、P2X3和 β-actin擴(kuò)增體系分別如下:DEPC 水 9.5 μl，cDNA 1 μl，上下游引物各 1 μl，2 ×Taq酶12.5 μl。PCR 反應(yīng)條件:94℃ 3 min;94℃ 45 s，56℃ 45 s，72℃ 45 s，共 35 個(gè)循環(huán);72℃ 5 min。各組取5 μl擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果、拍照，采用凝膠成像系統(tǒng)讀取分析目的電泳條帶，以各組β-actin為內(nèi)參將其相應(yīng)組P2X2、P2X3的灰度值標(biāo)化后進(jìn)行比較。

1.5.3 免疫組織化學(xué) 大鼠迅速斷頭，取手術(shù)側(cè)TG，用PBS沖洗后，4%多聚甲醛固定24 h，然后將組織浸入30%蔗糖脫水24 h，中途換糖水3次，4℃冰箱過(guò)夜。恒冷切片機(jī)將TG切成15 μm厚的薄片，烤片37℃，2 h，－20℃保存。二步法免疫組織化學(xué)染色，DAB顯色。顯微鏡下拍照，用Image tool圖像分析系統(tǒng)觀察分析光密度。

1.5.4 免疫熒光 前期準(zhǔn)備同免疫組化，免疫熒光過(guò)程按說(shuō)明書完成。熒光顯微鏡下拍照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Image tool圖像分析系統(tǒng)觀察分析光密度。

1.5.5 Western blot 將手術(shù)側(cè)大鼠TG置于2 ml勻漿器中球狀部位，加300 μl去污劑裂解液(含10%PMSF)于勻漿器中進(jìn)行冰上勻漿，充分裂解后移至1.5 ml離心管中，以12 000 r·min－1于 4℃ 離心5 min，取上清分裝于0.5 ml離心管中并置于－20℃保存。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，免疫學(xué)檢測(cè)，光密度分析。通過(guò)Image tool圖像分析軟件讀取目的條帶在X光膠片上測(cè)得的光密度掃描值，以各組β-actin條帶的掃描值標(biāo)化其相應(yīng)組P2X2、P2X3的蛋白表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)均以±s表示，各組數(shù)據(jù)間的統(tǒng)計(jì)采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠機(jī)械痛敏閾值測(cè)定 手術(shù)前Ⅰ組(Control組)、Ⅱ組(Sham組)、Ⅲ組(TN組)、Ⅳ組(TN+E)之間相比大鼠手術(shù)側(cè)眶下神經(jīng)面部感覺區(qū)域機(jī)械痛閾值差異沒有顯著性(P＞0.05)。術(shù)后2周內(nèi)，Ⅲ組(TN模型組)的機(jī)械痛反射閾值在雙側(cè)都有所下降，手術(shù)側(cè)下降更為明顯。術(shù)后d 1開始，Ⅲ組的手術(shù)側(cè)機(jī)械痛反射閾值與Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅳ組比較降低(P＜0.01)，并從術(shù)后d 3開始明顯并一直持續(xù)到14 d(P＜0.01)。從術(shù)后d 1開始，Ⅳ組的手術(shù)側(cè)機(jī)械痛反射閾值和Ⅰ、Ⅱ組比較有所降低(P＜0.01)，從d 11開始無(wú)差異，但從術(shù)后d 5開始與Ⅲ組比較明顯增加(P＜0.05)，見Fig 1。

Fig 1 Effect of emodin on the mechanical withdrawal threshold of TN rats(n=10)

Average optical density of P2X3mRNA in the four groups(n=10).##P ＜0.01 vs TN.(arrows indicated the immunostaining neurons;scale bars，100 μm)

Fig 2B Effects of emodin on the expression of P2X2receptor mRNA in trigeminal ganglion of each group by in situ hybridization on postoperative d 14

2.2 大鼠TG中P2X2/3受體表達(dá)的測(cè)定

2.2.1 原位雜交 術(shù)后14 d，原位雜交測(cè)定大鼠TG切片中P2X2/3受體mRNA的表達(dá)。于每只大鼠TG切片中隔5張取1張切片，用圖像分析系統(tǒng)軟件分析P2X2/3陽(yáng)性神經(jīng)元的光密度變化。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組P2X3陽(yáng)性神經(jīng)元的平均光密度分別為:0.2311±0.0204、0.2355 ±0.0216、0.5801 ±0.0422、0.3233±0.035。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組P2X2陽(yáng)性神經(jīng)元的平均光密度分別為:0.2551±0.0236、0.2678 ± 0.0253、0.5676 ± 0.0463、0.2933±0.0315。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅳ組之間P2X2/3受體表達(dá)差異無(wú)顯著性(P＞0.05);Ⅲ組TG中P2X2/3受體的表達(dá)較Ⅰ組、Ⅱ組明顯增加(P＜0.01);Ⅳ組TG中P2X2/3受體的表達(dá)較Ⅲ組低(P＜0.01)，見Fig 2。

2.2.2 RT-PCR 術(shù)后14 d，PCR方法測(cè)定各組三叉神經(jīng)節(jié)中P2X2/3受體mRNA的表達(dá)。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)軟件分析后，以β-actin為內(nèi)參將P2X3的灰度值進(jìn)行標(biāo)化，結(jié)果如下:Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組分別為:0.3081 ±0.0162、0.3111 ±0.0110、0.4979 ±0.0271、0.3359 ±0.0125。以β-actin為內(nèi)參將P2X2的灰度值進(jìn)行標(biāo)化，結(jié)果如下:0.3055±0.0167、0.3150±0.0132、0.6266 ±0.0199、0.3445 ±0.0131。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅳ組之間P2X2/3受體表達(dá)差異無(wú)顯著性(P＞0.05);Ⅲ組TG中P2X2/3受體的表達(dá)較Ⅰ組、Ⅱ組明顯增加(P＜0.01);Ⅳ組 TG中P2X2/3受體的表達(dá)較Ⅲ組低(P＜0.01)，見Fig 3。

Fig 3 Effects of emodin on the expression of P2X3receptor mRNA in TG of each group by RT-PCR on postoperative d 14(n=10)

2.2.3 免疫組織化學(xué) 術(shù)后14 d，免疫組化測(cè)定大鼠TG切片中P2X2/3受體的表達(dá)。于每只大鼠TG切片中隔5張取1張切片，用圖像分析系統(tǒng)軟件分析P2X2/3陽(yáng)性神經(jīng)元的光密度變化。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組P2X3陽(yáng)性神經(jīng)元的平均光密度分別為:0.1668±0.0246、0.1702 ±0.0197、0.3290 ±0.0283、0.1847±0.0210。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組P2X2陽(yáng)性神經(jīng)元的平均光密度分別為:0.1549±0.0183、0.1657 ± 0.0143、0.3548 ± 0.0243、0.1808±0.0228。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅳ組之間P2X2/3受體表達(dá)差異無(wú)顯著性(P＞0.05);Ⅲ組TG中P2X2/3受體的表達(dá)較Ⅰ組、Ⅱ組明顯增加(P＜0.01);Ⅳ組TG中P2X2/3受體的表達(dá)較Ⅲ組低(P＜0.01)，見Fig 4。

Fig 4A Effects of emodin on the expression of P2X3receptor protein in TG of each group by immunohistochemistry on postoperative d 14(n=10)

Fig 4B Effects of emodin on the expression of P2X2receptor protein in trigeminal ganglion of each group by immunohistochemistry on postoperative d 14(n=10)

2.2.4 免疫熒光 術(shù)后14 d，免疫熒光雙標(biāo)測(cè)定大鼠TG切片中P2X3、P2X2受體的表達(dá)。結(jié)果顯示，P2X3和P2X2共同表達(dá)于三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞上，且Ⅲ組TG中P2X2/3受體的表達(dá)較Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅳ組增加，見Fig 5。

2.2.5 蛋白印跡 術(shù)后14 d，Western blot方法測(cè)定各組三叉神經(jīng)節(jié)中P2X2/3受體蛋白的表達(dá)。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)軟件分析后，以β-actin為內(nèi)參將P2X3的光密度值進(jìn)行標(biāo)化，結(jié)果如下:Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組分別為:0.1523±0.0163、0.1632±0.0184、0.6666±0.0482、0.2319±0.0284。以 β-actin為內(nèi)參將P2X2的光密度值進(jìn)行標(biāo)化，結(jié)果如下:0.1879± 0.0174、0.1893 ± 0.0187、0.5362 ± 0.0429、0.3246±0.0262。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅳ組之間P2X2/3受體表達(dá)差異無(wú)顯著性(P＞0.05);Ⅲ組TG中P2X2/3受體的表達(dá)較Ⅰ組、Ⅱ組明顯增加(P＜0.01);Ⅳ組TG中P2X2/3受體的表達(dá)較Ⅲ組低(P＜0.01)，見Fig 6。

Fig 5 Colocation of P2X2and P2X3in TG by double-label immunofluorescence on postoperative d 14

3 討論

嘌呤受體分為P1和P2受體，ATP及其類似物作用于P2受體。P2受體分為配體門控性離子通道型受體(P2X受體)和G蛋白偶聯(lián)型受體(P2Y受體)［13］。大量研究顯示嘌呤受體中的P2X2/3受體參與疼痛的發(fā)病過(guò)程［14－16］。三叉神經(jīng)節(jié)中含有大量與外周痛覺傳導(dǎo)有關(guān)的中小型神經(jīng)細(xì)胞，并有P2X2/3受體的表達(dá)［17］，但目前 P2X2/3受體在三叉神經(jīng)痛的痛覺傳導(dǎo)過(guò)程中所起的作用還不是很清楚。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用大鼠三叉神經(jīng)痛模型研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后d 1開始，TN模型組的機(jī)械痛敏閾值降低，并從術(shù)后d 3開始更為明顯并一直持續(xù)到d 14。應(yīng)用RT-PCR和原位雜交技術(shù)檢測(cè)TN大鼠手術(shù)側(cè)TG中P2X2/3受體mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示TN模型大鼠TG中P2X2/3受體mRNA的表達(dá)明顯升高，免疫組化和蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)大鼠手術(shù)側(cè)TG中P2X2/3受體蛋白的表達(dá)，結(jié)果與其在mRNA水平的表達(dá)也基本一致。這些結(jié)果提示，P2X2/3受體蛋白和 mRNA的表達(dá)異常與三叉神經(jīng)痛密切相關(guān)。我們推測(cè)與外周痛覺傳遞有關(guān)的TG神經(jīng)元可能是通過(guò)激動(dòng)P2X2/3受體，參與痛覺的調(diào)制。慢性壓迫損傷眶下神經(jīng)造成的三叉神經(jīng)節(jié)P2X2/3受體免疫反應(yīng)陽(yáng)性數(shù)量增加，有可能是由于在神經(jīng)損傷位點(diǎn)，異位嘌呤能神經(jīng)敏感性增強(qiáng)，從而導(dǎo)致P2X受體上調(diào)所致。

Fig 6A Effects of emodin on the expression of P2X3receptor protein in TG of each group by Western blot on postoperative d 14(n=10)

Fig 6B Effects of emodin on the expression of P2X2receptor protein in trigeminal ganglion of each group by Western blot on postoperative d 14(n=10)

近年大量研究顯示嘌呤受體中的P2受體是參與痛覺傳遞的重要受體［18－19］，嘌呤受體可能成為疼痛治療的新靶點(diǎn)［20］。我們實(shí)驗(yàn)室以往的實(shí)驗(yàn)也顯示能特異性拮抗P2X3受體的川芎嗪、阿魏酸鈉等藥物對(duì)坐骨神經(jīng)壓迫損傷神經(jīng)病理痛大鼠的機(jī)械性痛覺異常和熱痛覺過(guò)敏有一定的緩解作用［21－22］。本實(shí)驗(yàn)我們采用大黃素進(jìn)行干預(yù)治療后發(fā)現(xiàn)，大黃素能明顯提高TN大鼠的機(jī)械痛敏閾值，而且從術(shù)后d 5開始明顯增加，于術(shù)后d 11開始和對(duì)照組差異無(wú)顯著性。這些結(jié)果表明大黃素對(duì)TN大鼠的機(jī)械痛敏具有一定的抑制作用，可以緩解TN大鼠神經(jīng)病理痛的行為學(xué)表現(xiàn)。用大黃素對(duì)TN大鼠進(jìn)行治療后，RT-PCR和原位雜交技術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明TN大鼠手術(shù)側(cè)TG中升高的P2X2/3受體mRNA表達(dá)有明顯下降，免疫組化和蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)結(jié)果也表明大鼠手術(shù)側(cè)TG中P2X2/3受體蛋白的表達(dá)也有明顯下降。因此提示大黃素可能是通過(guò)抑制P2X2/3受體表達(dá)上調(diào)而對(duì)三叉神經(jīng)痛大鼠的機(jī)械痛敏發(fā)揮抑制作用，大黃素對(duì)P2X2/3受體介導(dǎo)的三叉神經(jīng)痛具有一定抑制作用。

總之，TN是一個(gè)非常復(fù)雜的病理過(guò)程，對(duì)原發(fā)性三叉神經(jīng)痛迄今為止還沒有一個(gè)確切的病因解釋，也沒有特別有效且副作用比較小的藥物治療，有必要進(jìn)一步研究該病的分子機(jī)制，以便尋找新的治療方法。本研究表明P2X2/3受體涉及到TN大鼠的疼痛傳遞過(guò)程，大黃素可以降低TN大鼠 TG中P2X2/3受體的表達(dá)，抑制TN大鼠的機(jī)械痛敏，提示大黃素有可能成為TN治療的新的靶點(diǎn)藥物，促進(jìn)TN的治療發(fā)展。

［1］Obermann M，Katsarava Z.Update on trigeminal neuralgia［J］.Expert Rev Neurother，2009，9(3):323－9.

［2］Boto G R.Trigeminal neuralgia［J］.Neurocirugía，2010，21(5):361－72.

［3］Zakrzewska J M.Medical management of trigeminal neuropathic pains［J］.Expert Opin Pharmacotherapy，2010，11(8):1239－54.

［4］Yang M，Zhou M，He L，et al.Non-antiepileptic drugs for trigeminal neuralgia［J］.Cochrane Database Syst Rev，2011，19(1):CD004029.

［5］張 君，李 欣，劉 晗，等.嘌呤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的新方法［J］.

中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(7):858－61.

［5］Zhang J，Li X，Liu H，et al.The new methods of purinergic signalling research［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(7):858－61.

［6］高 云，梁尚棟，邵立建，等.川芎嗪對(duì) P2X3受體介導(dǎo)的神經(jīng)病理痛的作用研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2007，23(4):458－62.

［6］Gao Y，Liang S D，Shao L J，et al.Effect of TMP on neuropathic pain mediated by P2X3receptor［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23(4):458－62.

［7］Jarvis M F.The neural-glial purinergic receptor ensemble in chronic pain states［J］.Trends Neurosci，2010，33(1):48－ 57.

［8］Gunosewoyo H，Kassiou M.P2X purinergic receptor ligands:recently patented compounds［J］.Expert Opin Ther Pat，2010，20(5):625－46.

［9］Myers R R，Campana W M，Shubayev V I.The role of neuroinflammation in neuropathic pain:mechanisms and therapeutic targets［J］.Drug Disov Today，2006，11(1－2):8－20.

［10］Wang C，Zhang D，Ma H，et al.Neuroprotective effects of emodin-8-O-beta-D-glucosidein vivoandin vitro［J］.Eur J Pharmacol，2007，577(1－3):58－63.

［11］Erlinge D，Burnstock G.P2 receptors in cardiovascular regulation and disease［J］.Purin Ergic Signal，2008，4(1):1－ 20.

［12］Vos B P，Strassman A M，Maciewicz R J.Behavioral evidence of trigeminal neuropathic pain following chronic constriction injury to the rat’s infraorbital nerve［J］.J Neurosci，1994，14(5 Pt 1):2708－23.

［13］Jarvis M F，Burgard E C，McGaranghty S，et al.A-317491，a novel potent and selective non nucleotide antagonist of P2X3and P2X2/3receptors，reduces chronic inflammatory and neuropathic pain in the rat［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(26):17179－84.

［14］Wan F，Li G，Liu S，et al.P2X2/3receptor activity of rat nodose ganglion neurons contributing to myocardial ischemic nociceptive signaling［J］.Auton Neurosci，2010，158(1－2):58－64.

［15］Gao Y，Liu H，Deng L，et al.Effect of emodin on neuropathic pain transmission mediated by P2X2/3receptor of primary sensory neurons［J］.Brain Res Bull，2011，84(6):406－13.

［16］Ballini E，Virginio C，Medhurst S J，et al.Characterization of three diaminopyrimidines as potent and selective antagonists of P2X3and P2X2/3receptors within vivoefficacy in a pain model［J］.Br J Pharmacol，2011，163(6):1315－25.

［17］Gu Y Z，Yin G F，Guan B C，et al.Characteristics of P2X purinoceptors in the membrane of rat trigeminal ganglion neurons［J］.Sheng Li Xue Bao，2006，58(2):164－70.

［18］雷 潔，王元銀，劉安東，等.ATP對(duì)大鼠三叉神經(jīng)節(jié)小直徑神經(jīng)元胞內(nèi)鈣濃度的調(diào)制作用及其機(jī)制［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(11):1450－4.

［18］Lei J，Wang Y Y，Liu A D，et al.ATP-induced intracellular calcium signal transduction mechanism in the small trigeminale ganglion neurons of rat［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(11):1450－ 4.

［19］Shinoda M，Kawashima K，Ozaki N，et al.P2X3receptor mediates heat hyperalgesia in a rat model of trigeminal neuropathic pain［J］.J Pain，2007，8(7):588－97.

［20］Burnstock G.Purinergic P2 receptors as targets for novel analgesics［J］.Pharmacol Ther，2006，110(3):433－54.

［21］Gao Y，Xu C，Liang S，et al.Effect of tetramethylpyrazine on primary afferent transmission mediated by P2X3receptor in neuropathic pain states［J］.Brain Res Bull，2008，77(1):27－32.

［22］Zhang A，Gao Y，Zhong X，et al.Effect of sodium ferulate on the hyperalgesia mediated by P2X3receptor in the neuropathic pain rats［J］.Brain Res，2010，1313(2):215－21.