郝樹芳，周嫻穎，謝淑武，周潔蕓，郭湘潔，李 釗，桂幼倫，朱偉杰，朱 焰

(1.暨南大學生命科學技術學院，生殖免疫研究所，廣東 廣州 510632;2.上海市計劃生育科學研究所，國家人口和計劃生育委員會計劃生育藥具重點實驗室生殖藥理組，上海 200032;3.復旦大學，上海 200032)

子宮內膜異位癥(endometriosis，EMs)是指具有生長功能的子宮內膜組織出現在子宮腔被覆粘膜以外的身體其他部位所造成的一種疾病，它是當今國內外婦產科的多發(fā)病和常見?。?］。該病導致的疼痛和不孕，嚴重困擾著患者的健康和生活質量。諾美孕酮(nomegestrol acetate，NOMAc)是第4代孕激素的代表，研究顯示［2］它可以通過抑制性調節(jié)促性腺激素釋放激素(GnRH)，在垂體水平控制促性腺激素的釋放，抑制排卵。NOMAc還可抑制孕酮誘導的上皮細胞分泌，抑制子宮內膜增生，有助于EMs的治療，但作用機制還少見報道。為此，我們應用實驗性EMs大鼠模型，研究NOMAc對血清中EMAb水平的影響和異位內膜中凋亡相關因子Bcl-2、Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 ♀成熟未孕清潔級SD(Sprague Dawley)大鼠65只，實驗前體質量為200～250 g，由上海西普爾-必凱公司提供，合格證號:SCXK(滬)2008-0016。

1.1.2 藥品和試劑 諾美孕酮醋酸酯:純度99.49%，由浙江仙琚制藥股份有限公司提供，批號:100405-8;孕三烯酮膠囊:由北京紫竹藥業(yè)有限公司生產，批號:53100201340。ELISA試劑盒(EMAb)購自美國ADL生物科技公司;蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司;Bax、Bcl-2、β-actin購自美國 S anta Cruz公司;Caspase-9、Caspase-3、HRP 標記的羊抗兔 I gG，購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 參照文獻［3］選取動情周期規(guī)則的SD大鼠65只。手術在無菌環(huán)境中進行，以3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠1 ml·kg-1。將大鼠仰臥四肢固定于手術臺上，腹部消毒后做2～3 cm切口，游離右側子宮，剪取靠近卵巢處約1.5 cm一段子宮置入含生理鹽水的培養(yǎng)皿中，肌層與子宮內膜層分離后，將內膜剪成5 mm×5 mm大小與腹壁肌肉縫合固定，常規(guī)關腹。

1.2.2 模型的判定 模型建立3周后，第2次剖腹，用游標卡尺測量移植物的長mm、寬mm、高mm，并記錄觀察移植物的生長情況，存活與否。EMs模型建模成功觀察標準［4］:移植灶體積增大(體積大于25 mm3;高度大于1 mm)，呈透明的結節(jié)狀、囊狀、有澄清液體積聚，移植物被結締組織覆蓋并有血管形成，質地軟。

1.2.3 分組給藥及解剖取材 造模成功的大鼠隨機分為模型對照組(0.5%CMC-Na 1.5 ml·kg-1·d-1)、孕三烯酮陽性對照(1.5 mg·kg-1·d-1)以及諾美孕酮(0.5、1.5、15 mg·kg-1·d-1)，分別相當于人(60 kg)用劑量 5、15、150 mg·d-1，每組 13只。孕三烯酮和諾美孕酮溶解于0.5%CMC-Na中配成混懸液。連續(xù)灌胃21 d，在末次給藥24 h內麻醉解剖大鼠，經腹主動脈取血，測量異位內膜大小，立即取出異位內膜組織，于液氮保存。

1.2.4 HE染色和異位子宮內膜厚度測量 將置于4%多聚甲醛中固定的正常子宮和異位內膜進行常規(guī)石蠟包埋，HE染色，光學顯微鏡下觀察正常子宮及異位內膜組織形態(tài)學特點。每張切片隨機選取10個不同位置，用圖像分析軟件測量內膜厚度，最后取均值。

1.2.5 ELISA檢測血清中EMAb水平 測定方法按照說明書操作步驟進行，所有樣本均設置復孔檢驗以減少誤差。最后在450 nm波長處讀取吸光度值，做出標準曲線讀出EMAb的濃度。

1.2.6 Western blot分析 異位內膜組織加蛋白裂解液冰上勻漿，離心后取上清液。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。每份樣本取80 μg進行12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜110 V，1.5 h，一抗Bcl-2(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)、Caspase-9(1∶1 000)和Caspase-3(1 ∶1 000)4℃孵育過夜，HRP標記的羊抗兔IgG(1∶2 000)和β-actin(1∶1 000)室溫孵育1 h，ECL顯色液顯影，掃描灰度值。各目的條帶與β-actin條帶灰度值的比值作為該目的蛋白的相對表達量。

Fig 1 Effect of NOMAc on eutopic endometrium and ectopic endometrium of rats(100×)

2 結果

2.1 諾美孕酮對在位子宮內膜及異位內膜形態(tài)結構的影響 鏡下觀察到在位子宮內膜上皮細胞為柱狀;間質細胞小而密，腺體數量多，腺腔小，可見核下空泡和頂漿分泌(Fig 1A)。模型對照組異位內膜生長良好，胞質豐富，腺體數量多，腺腔大，腔內有滲出物(Fig 1B)。NOMAc(0.5、1.5、15 mg·kg-1)異位內膜萎縮，囊內積液體積減少，間質疏松，腺體數目明顯減少，腺腔明顯萎縮，NOMAc(15 mg·kg-1)部分動物異位內膜消失(Fig 1D～F)。

2.2 諾美孕酮對異位子宮內膜厚度的影響 與模型對照組相比，NOMAc(0.5、1.5、15 mg·kg-1)在位子宮內膜厚度差異無顯著性(P＞0.05)。NOMAc(0.5、1.5、15 mg·kg-1)異位內膜厚度呈劑量依賴性地降低，且與模型對照組相比差異有顯著性(P＜0.05)(Tab 1)。提示NOMAc對在位子宮內膜厚度無影響，而可以降低異位子宮內膜厚度。

Tab 1 Effect of NOMAc on the thickness of eutopic and ectopic endometrium in rats(±s，n=5)

Tab 1 Effect of NOMAc on the thickness of eutopic and ectopic endometrium in rats(±s，n=5)

*P＜0.05 vs model group;#P＜0.05 vs gestrinone group

Group Dose/mg·kg-1 Endometrium thickness Eutopic/μm Ectopic/μm Model - 506.98±122.43 1515.50±492.89 Gestrinone 1.5 547.28±78.66 1063.07±267.23*NOMAc low 0.5 554.6±101.08 669.27±164.51*NOMAc medium 1.5 602.88±120.49 641.79±553.15*NOMAc high 15 534.36±100.69 553.25±268.01*#

2.3 諾美孕酮對血清中EMAb水平的影響 NOMAc(0.5、1.5、15 mg·kg-1)血清中 EMAb 水平呈劑量依賴性地降低。與模型對照組相比，NOMAc(15 mg·kg-1)血清中EMAb水平明顯降低(P＜0.05)，見 Tab 2。

Tab 2 Effect of NOMAc on the concentration of EMAb of blood serum in rats(±s，n=5)

Tab 2 Effect of NOMAc on the concentration of EMAb of blood serum in rats(±s，n=5)

*P＜0.05 vs model group

Group Dose/mg·kg-1 EMAb/μg·L -1 Model - 4.00±0.65 Gestrinone 1.5 3.94±0.84 NOMAc low 0.5 3.64±0.59 NOMAc medium 1.5 3.40±0.64 NOMAc high 15 3.37±0.44*

2.4 諾美孕酮對Bcl-2、Bax表達的影響 免疫印跡結果顯示，Bax隨NOMAc劑量增大表達增加，而Bcl-2隨NOMAc劑量增大表達減少。與模型對照組相比，NOMAc(1.5、15 mg·kg-1)Bax和 Bcl-2 蛋白的表達差異有顯著性(P＜0.05)，見Fig 2。

2.5 諾美孕酮對Caspase-3 and Caspase-9表達的影響 免疫印跡結果顯示，在模型對照組中Caspase-3、剪切后Caspase-3和Caspase-9蛋白表達較少，在孕三烯酮對照和NOMAc(0.5、1.5、15 mg·kg-1)表達增加，且與NOMAc劑量效應呈正相關。與模型對照組相比，NOMAc(15 mg·kg-1)Caspase-3、剪切后Caspase-3和Caspase-9表達明顯升高(P＜0.05)，見 Fig 3。

3 討論

EMs所導致的痛經和慢性盆腔疼痛、性交痛、月經異常以及不孕已嚴重困擾著患者的健康和生活質量［5］。細胞凋亡異常可能是EMs發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。在臨床中，可以通過藥物或其它細胞因子誘導異位內膜細胞凋亡，同時又不損傷正常組織細胞，從而達到治療EMs的目的。如常用治療藥物GnRH-a能夠提高EMs在位和異位內膜細胞的凋亡;長期口服避孕藥通過降低Bcl/Bax的比例提高EMs在位內膜細胞的凋亡;丹那唑組織異位組織DNA 合成，誘導細胞凋亡［6］。

Fig 2 Effect of NOMAc on the expression of Bcl-2，Bax of ectopic endometrium in rats(n=5)

NOMAc是一種19-去甲孕酮衍生物，與天然的黃體酮極其相似，被看作是“純”孕激素。NOMAc有很強的孕激素活性，與天然E2合用時，可獲得良好的避孕效果和月經周期調控，2011年8月已獲準在歐洲上市。NOMAc對糖代謝、脂代謝、血液學、肝臟微粒體酶無明顯影響。體外研究顯示，NOMAc可抑制正常乳腺組織和乳腺癌細胞中雌酮向E2的轉換，不刺激乳腺癌細胞增生，因而不會增加乳腺癌的發(fā)病率［7-8］。還可以用于治療 EMs［9］。然而作用機制還少見報道。孕激素主要通過抗炎鎮(zhèn)痛、調節(jié)內分泌功能、改變血液流變性、調節(jié)免疫功能、促進異位組織凋亡、抑制血管形成等方面治療EMs［10］。

Fig 3 Effect of NOMAc on the expression of Caspase-9，Caspase-3and cleaved Caspase-3 of ectopic endometrium in rats(n=5)

本文結果顯示NOMAc可以使異位內膜明顯萎縮，降低異位內膜厚度，對正常子宮內膜厚度無明顯影響。表明NOMAc可以抑制異位內膜增生，同時不影響正常子宮內膜生長。

EMAb是EMs的標志抗體。在卵巢激素作用下，異位內膜種植灶產生的內膜碎屑沉入盆腔，被巨噬細胞吞噬后，內膜中一些抗原成分識別，激活機體免疫系統(tǒng)，產生EMAb。眾多研究表明EMs患者EMAb陽性率明顯升高，且隨病情加重或好轉，EMAb水平也隨之升高或降低［11］。本實驗研究結果表明 NOMAc(0.5、1.5、15 mg·kg-1)可以降低大鼠血清中的EMAb，提示NOMAc對EMs的作用機制可能與降低EMAb水平有關。

細胞凋亡涉及一系列的蛋白，Bcl-2是凋亡抑制基因，Bax是促凋亡基因。Taniguchi等［12］報道，Bcl-2在正常子宮內膜中隨月經周期而發(fā)生變化，增生期最強，分泌早、中期減少，分泌晚期及月經期消失，其消失恰與月經周期中的凋亡增加一致。異位的子宮內膜在離開宮腔后仍然可以繼續(xù)增長是和細胞凋亡受到抑制有關。由于細胞凋亡受到抑制，異位內膜可通過Bcl-2蛋白高表達、Bax蛋白低表達來增強自身的抗凋亡的能力，得以在子宮腔被覆粘膜以外種植和生長［13］。本實驗結果表明 NOMAc(0.5、1.5、15 mg·kg-1)對Bcl-2和Bax的表達分別有下調和上調作用，且呈劑量效應關系。高劑量組差異呈顯著性(P＜0.05)。提示NOMAc可以通過調節(jié)Bcl-2和Bax水平，發(fā)揮抑制異位內膜生長的作用。

Caspase家族蛋白在不同凋亡激活途徑中都起到關鍵的作用。Caspase-9是內源性凋亡途徑的啟動因子，Caspase-3是位于級聯(lián)反應下游的最重要的凋亡效應分子，能被上游的啟動因子激活［14］。本實驗進一步研究表明NOMAc可明顯升高Caspase-9和Caspase-3蛋白表達水平(P＜0.05)。提示NOMAc(0.5、1.5、15 mg·kg-1)通過上調異位內膜細胞內源性凋亡啟動因子Caspase-9，從而激活凋亡執(zhí)行因子Caspase-3來達到促進異位內膜細胞凋亡的目的。

綜上所述，我們認為 NOMAc(0.5、1.5、15 mg·kg-1)可促進大鼠子宮異位內膜細胞凋亡，其作用機制可能與降低EMAb水平、上調Bax和下調Bcl-2蛋白表達、激活細胞凋亡的內源性途徑啟動因子Caspase-9蛋白、激活執(zhí)行因子Caspase-3蛋白表達有關。NOMAc是否還通過其他作用機制發(fā)揮治療EMs的作用，還需進一步實驗證明。

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