劉家蘭，鄧禮娟，原歡歡，王 琴，徐曉玉

(西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶市藥效評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心，重慶 400715)

大腦中動(dòng)脈是臨床上缺血性腦血管病的易患部位，血管閉塞造成局部腦血流循環(huán)障礙［1］。局灶腦缺血模型是目前研究腦缺血疾病的經(jīng)典模型，其成功率高，梗死范圍穩(wěn)定，損傷小，大鼠或者小鼠造模均可，線栓法雖然死亡率高，卻是更適合于長期對(duì)腦缺血疾病研究的模型［2］。課題組長期致力于中藥新藥對(duì)腦缺血疾病的研究，曾建立過對(duì)局灶腦缺血大鼠前肢功能評(píng)價(jià)的一種新方法［3］。本文對(duì)藥效學(xué)研究的一種實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。國內(nèi)外已有大量關(guān)于線栓法致小鼠局灶腦缺血模型的構(gòu)建方法，其損傷程度的評(píng)價(jià)指標(biāo)移植于大鼠評(píng)價(jià)體系，但大鼠與小鼠在身體機(jī)能方面有很大差異，評(píng)價(jià)指標(biāo)是否客觀合理有待驗(yàn)證。Bederson等［4］研究認(rèn)為神經(jīng)系統(tǒng)體征評(píng)分與腦梗死體積明顯相關(guān)，Shen等［5］發(fā)現(xiàn)術(shù)后自發(fā)活動(dòng)與腦梗死體積明顯相關(guān)。本文選取了國內(nèi)外常用的神經(jīng)功能評(píng)價(jià)方法，以經(jīng)典的Longa等［6］五分法和腦梗死面積百分比為參照，考察線栓法小鼠局灶永久性腦缺血模型行為學(xué)指標(biāo)間的相關(guān)性。以療效確切的血管擴(kuò)張劑葛根素［7］，自由基清除劑依達(dá)拉奉［8］治療模型小鼠，觀察所選指標(biāo)能否用于評(píng)價(jià)藥物對(duì)該模型的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康KM小鼠150只，體質(zhì)量25～30 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［許可證號(hào):SCXK(渝)2007-0001］，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證:SYXK(渝)2009-0002，環(huán)境適應(yīng)1周。

1.2 藥品與試劑 葛根素(純度≥98%，四川玉鑫藥業(yè)有限公司，批號(hào):090602);依達(dá)拉奉注射液(吉林省輝南長龍生化藥業(yè)股份有限公司，批號(hào):2010050201);水合氯醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，2，3，5氯化三苯基四氮唑(北京鼎國生物技術(shù)有限公司)。

1.3 腦缺血模型的建立 小鼠適應(yīng)喂養(yǎng)1周后用于模型制備。術(shù)前禁食不禁水12 h，3.5%水合氯醛(35 mg/10 g)ip麻醉;頸部正中切口，剝離并暴露頸動(dòng)脈三角;分離出左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈;用電凝器尖端凝斷頸外動(dòng)脈，在其根部扎口，將線栓(直徑0.10 mm)插入頸內(nèi)動(dòng)脈，當(dāng)栓線標(biāo)記(離頭端1 cm)在頸總動(dòng)脈分叉處，略微感到阻力時(shí)停止插入，固定栓線，縫合皮膚。假手術(shù)組不插入線栓，其余處理同上，造模后3 h進(jìn)行首次神經(jīng)功能評(píng)分，棄掉因失血過多，造模時(shí)間超過15 min者。

1.4 動(dòng)物分組 實(shí)驗(yàn)一:小鼠70只，♀♂各半，10只假手術(shù)組，60只用于模型的制備，造模成功的31只用于神經(jīng)功能評(píng)分指標(biāo)的觀察。實(shí)驗(yàn)二:小鼠80只，♂，用于葛根素和依達(dá)拉奉對(duì)腦缺血模型的改善效果觀察，將模型成功的63只小鼠隨機(jī)分為模型組、葛根素組和依達(dá)拉奉組，每組21只;剔除造模后d 1～8死亡且無腦缺血病理改變的小鼠，最終用于神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分的動(dòng)物為假手術(shù)組10只，模型組10只，葛根素組12只，依達(dá)拉奉組12只;術(shù)后3 h第1次尾iv給藥，每天1次，連續(xù)7 d，假手術(shù)組和模型組尾靜脈注射同等體積的生理鹽水。

1.5 神經(jīng)功能行為學(xué)測(cè)試 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分:參照Longa等［6］五分法，術(shù)后 d 1、d 4 和 d 7 對(duì)小鼠進(jìn)行評(píng)分。即0分，無神經(jīng)損害癥狀;1.0分，不能完全伸展損傷對(duì)側(cè)前肢;2.0分，屈曲姿勢(shì)，旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng);3.0分，行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒;4.0分，不能自發(fā)行走，痙攣、昏睡，意識(shí)喪失。

神經(jīng)綜合功能評(píng)分:參照Petullo等［9］的行為學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。術(shù)前3 d對(duì)小鼠進(jìn)行訓(xùn)練，包括3個(gè)方面:神經(jīng)肌肉功能、前庭運(yùn)動(dòng)功能和綜合神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能，總分20，分?jǐn)?shù)越高，代表缺血性腦損傷越嚴(yán)重。

轉(zhuǎn)角試驗(yàn)［10］:將小鼠放在兩塊30 cm×20 cm×1 cm的木板間，兩木板呈30°角，兩板之間有一小縫鼓勵(lì)小鼠進(jìn)入這個(gè)轉(zhuǎn)角，將小鼠面朝轉(zhuǎn)角放置于去轉(zhuǎn)角的半路上，當(dāng)小鼠走進(jìn)轉(zhuǎn)角時(shí)，兩邊的觸須會(huì)碰到木板，此時(shí)小鼠會(huì)向前或向上移，最后會(huì)向左或向右轉(zhuǎn)回。腦缺血小鼠會(huì)優(yōu)先向非損傷側(cè)轉(zhuǎn)回，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)10次，記錄下向右的次數(shù)。

爬板試驗(yàn)［11］:將小鼠放于一包有銅絲網(wǎng)25 cm×20 cm(孔徑0.2 mm)的有機(jī)玻板上，先保持平板于水平位置，后逐漸豎起平板，直至小鼠不能攀爬而從平板上落下，記錄該時(shí)平板軸線與水平面之間的角度(Holding angle)，每只小鼠重復(fù)3次，記平均值。即0 分，≥ 70°;1 分，≥ 65°～69°;2 分，≥ 60°～64.9°;3 分，≥ 55°～59.9°;4 分，＜55°。

1.6 腦梗死灶體積測(cè)定 術(shù)后d 8，神經(jīng)功能評(píng)分后，斷頭取大腦，－20℃冷凍8 min，取出沿視交叉冠狀切成約2 mm厚的4個(gè)切片，浸入37℃ 2%TTC溶液中避光染色15 min，4%多聚甲醛固定1 d，濾紙吸干，用小鑷子分開紅色和白色腦組織，稱重，計(jì)算腦梗死質(zhì)量占全腦的百分比。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后癥狀及成功率 術(shù)后造模成功小鼠，表現(xiàn)為活動(dòng)減少，左眼微閉，行動(dòng)遲緩，呼吸窘迫，進(jìn)食困難，腹瀉，皮毛豎立，腦損傷對(duì)側(cè)前肢卷曲，呈追尾狀轉(zhuǎn)圈等癥狀，從d 1～8體重不斷下降;假手術(shù)組僅左眼微閉，無神經(jīng)功能缺損癥狀，體重變化較小(Fig 1)。實(shí)驗(yàn)一中，60只造模小鼠，8只術(shù)后無神經(jīng)功能缺損癥狀，2只蛛網(wǎng)膜下腔出血，手術(shù)成功50只，成功率約為83.3%;實(shí)驗(yàn)二中70只造模小鼠，7只術(shù)后無神經(jīng)功能缺損癥狀，4只蛛網(wǎng)膜下腔出血，手術(shù)成功59只，成功率為84.3%。

Fig 1 Weight of mouse after operation

2.2 術(shù)后死亡率 實(shí)驗(yàn)一中50只造模成功小鼠，從d 1～8，總共死亡19只，用于觀察31只，死亡率38%;實(shí)驗(yàn)二中59只造模成功小鼠，從d 1～8，死亡25只，死亡率為42.3%。

2.3 神經(jīng)功能指標(biāo)的相關(guān)性 對(duì)術(shù)后小鼠d 1、d 4和d 7進(jìn)行評(píng)分(Tab 1)。神經(jīng)行為學(xué)與其他指標(biāo)在d 1、d 4和d 7中的相關(guān)性存在差異。結(jié)果顯示，神經(jīng)行為學(xué)與神經(jīng)綜合功能評(píng)分、爬板試驗(yàn)和轉(zhuǎn)角試驗(yàn)在術(shù)后d 1相關(guān)性最強(qiáng)，d 4神經(jīng)行為學(xué)與神經(jīng)綜合功能仍相關(guān)，與其他指標(biāo)無相關(guān)性(Tab 2)。

Tab 1 Neurological function scores of sham and ischemia mice

2.4 腦梗死百分比與神經(jīng)功能指標(biāo)相關(guān)性 將腦梗死百分比與腦缺血術(shù)后d 7的神經(jīng)功能指標(biāo)評(píng)分進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，腦梗死百分比的大小與神經(jīng)行為學(xué)、神經(jīng)綜合功能評(píng)分和爬板試驗(yàn)均相關(guān)，與轉(zhuǎn)角試驗(yàn)相關(guān)性差異無顯著性(Tab 3、Fig 2)。

Fig 2 Correlation between infarction percentage and neurological function indicators

Tab 2 Correlation efficient between neurologicalbehavioral score and neurological function indicators(n=31)

2.5 藥物對(duì)腦損傷小鼠的作用 根據(jù)以上神經(jīng)功能指標(biāo)的探討，我們選取了神經(jīng)行為學(xué)、神經(jīng)綜合功能和爬板試驗(yàn)觀察藥物對(duì)腦缺血小鼠的作用。術(shù)后d 1～8陸續(xù)有動(dòng)物死亡，將最終存活下來并具腦缺血病理特征的小鼠進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，葛根素與依達(dá)拉奉組在術(shù)后d 4和d 7腦損傷程度有明顯的改善(Tab 4)。TTC染色顯示梗死區(qū)為白色，正常區(qū)域?yàn)榧t色，假手術(shù)組均呈紅色。模型組梗死區(qū)域較大，占據(jù)大腦皮層及海馬區(qū);與模型組相比，葛根素組和依達(dá)拉奉組梗死面積百分比減小(Tab 5、Fig 3)。

Tab 3 Correlation efficient between infarction percentage and neurological function indicators(n=26)

3 討論

3.1 模型制備的成功要素 小鼠品系:不同小鼠品系造成的損傷程度不同，品系間的梗死體積不同主要是由大腦Willis環(huán)的解剖差異所致。昆明種小鼠不如BALB/c小鼠對(duì)腦缺血敏感，但梗死體積穩(wěn)定，且不易死亡［12］。

Fig 3 Brain TTC staining of mice

Tab 4Effects of drug group on neurological function behavioral score(±s)

Tab 4Effects of drug group on neurological function behavioral score(±s)

＊＊P＜0.01 vs sham group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs model group

Indicator Group Dose/mg·kg－1 n d 1 d 4 d 7 Neurological behavioral scoreSham－100 0 0 Model － 10 2.00 ±0.68＊＊ 1.60 ±0.42＊＊ 1.50 ±0.42＊＊Puerarin 40 12 2.00 ±0.43 1.17 ±0.58## 1.17 ±0.58##Edaravone 4.5 12 2.08 ±0.52 1.33 ±0.65# 1.08 ±0.52##Neurological comprehensive function score Sham－100 0 0 Model － 10 9.8 ±1.60＊＊ 7.80 ±1.42＊＊ 6.80 ±0.42＊＊Puerarin 40 12 9.58 ±0.87 6.75 ±0.54## 5.92 ±0.67##Edaravone 4.5 12 9.58 ±1.16 6.63 ±0.71## 6.00 ±0.60##Inclined plane test score Sham － 10 0.20 ±0.42 0.30 ±0.67 0.20 ±0.42 Model － 10 3.00 ±0.67＊＊ 2.30 ±0.67＊＊ 2.10 ±0.57＊＊Puerarin 40 12 3.00 ±0.85 1.50 ±0.52## 1.42 ±0.51#Edaravone 4.5 12 3.17 ±0.58 1.75 ±0.62## 1.33 ±0.65#

Tab 5Effect of drug on infarction size percentage(±s)

Tab 5Effect of drug on infarction size percentage(±s)

＊＊P ＜0.01 vs sham group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs model group

Group Dose/mg·kg－1 n Brain total weight/g Infarction weight/g Inf arction percentage/%Sham － 10 0.32 ±0.03 0 0 Model － 10 0.30 ±0.05 0.05 ±0.02 17.23 ±6.21＊＊Puerarin 40 12 0.29 ±0.05 0.04 ±0.01 14.48 ±3.20#Edaravone 4.5 12 0.30 ±0.04 0.04 ±0.02 13.63 ±4.75##

體重和性別:小鼠個(gè)體的大小對(duì)手術(shù)損傷的耐受力和模型成功與否有一定影響。選取體重為26～30 g小鼠，大小適中，制得的模型均一。術(shù)后小鼠存活率與性別也有很大關(guān)系，♂的耐受性較♀好，存活時(shí)間更長。

操作過程:造模過程中，盡量避免損傷血管周圍組織和迷走神經(jīng)?？捎眯√?hào)針頭在插線端血管扎一小口，插入線栓時(shí)要調(diào)整好進(jìn)線方向，輕柔慢進(jìn)，如在10～11 mm的位置遇到阻力，證明線栓進(jìn)入位置正確，若沒有，退出線栓調(diào)整方向再進(jìn)?？刹挥脛?dòng)脈夾，在ICA近腦端用縫合線栓個(gè)活結(jié)，線栓插入后用鑷子輕輕拉開活結(jié)即可，插入深度不易超過12 mm。

麻醉劑:麻醉劑對(duì)模型的成功影響較大，國內(nèi)常用水合氯醛，易引起呼吸道堵塞。造模過程中，如果遇到呼吸抑制的小鼠，可用小直鑷夾取少許棉花伸入氣管中，取出黏液，同時(shí)節(jié)律性地壓迫心臟，小鼠可快速恢復(fù)正常呼吸，減少死亡率。

3.2 模型中指標(biāo)的選擇 在腦缺血疾病的觀察中，如何選取能真實(shí)反映疾病程度的指標(biāo)相當(dāng)重要。神經(jīng)功能行為學(xué)指標(biāo)對(duì)慢性腦缺血疾病的研究具有重要作用。實(shí)驗(yàn)表明，線栓法制備的小鼠局灶永久性腦缺血模型死亡率較高，腦梗死體積恒定，神經(jīng)功能障礙明顯。Longa評(píng)分與實(shí)驗(yàn)中所選指標(biāo)在短期內(nèi)相關(guān)性強(qiáng)，相關(guān)程度隨時(shí)間而降低;腦梗死百分率與多數(shù)指標(biāo)呈正相關(guān)。葛根素、依達(dá)拉奉能明顯降低局灶性腦缺血損傷，表明可通過行為學(xué)指標(biāo)分值預(yù)測(cè)腦梗死程度。在行為學(xué)指標(biāo)的定量檢測(cè)中，不同指標(biāo)反映不同的功能，神經(jīng)行為學(xué)主要反映前肢功能和偏癱癥狀，不需借助任何設(shè)備，是最為經(jīng)典簡(jiǎn)單易行的評(píng)價(jià)方法，分值設(shè)置少間距大，對(duì)局灶腦缺血損傷的藥效觀察敏感性較差，可以考慮增加分值數(shù)，縮短間距;神經(jīng)綜合功能反映了肌肉運(yùn)動(dòng)功能、前庭運(yùn)動(dòng)功能和平衡綜合能力，與梗死質(zhì)量百分比的相關(guān)性最強(qiáng)，對(duì)腦缺血疾病的藥效觀察敏感性較高，是較為理想的行為學(xué)評(píng)價(jià)方法，但評(píng)價(jià)過程較復(fù)雜;爬板試驗(yàn)反映協(xié)調(diào)和平衡能力，與梗死體積的相關(guān)性較強(qiáng)，穩(wěn)定且操作簡(jiǎn)單，可用于腦缺血疾病的藥效觀察;轉(zhuǎn)角試驗(yàn)用于測(cè)定前腦和紋狀體的損傷程度，與梗死質(zhì)量百分比無相關(guān)性，用于藥效的觀察可能需加大樣本量以減少個(gè)體差異。為降低觀察者主觀因素和個(gè)體差異的影響，藥物對(duì)腦缺血損傷的評(píng)價(jià)，建議加大樣本量和多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)。國內(nèi)外關(guān)于小鼠神經(jīng)功能行為學(xué)指標(biāo)較多，如:煙囪試驗(yàn)［13］、旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)［14］、梯子試驗(yàn)［15］、圓柱體試驗(yàn)［16］、懸掛試驗(yàn)、水謎宮、肌力測(cè)試等，分別從腦損傷引起的肌肉、平衡、運(yùn)動(dòng)、記憶和認(rèn)知功能障礙進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)急性腦缺血和長期神經(jīng)功能修復(fù)進(jìn)行觀察，但是否可用于對(duì)小鼠永久局灶性腦缺血模型的評(píng)定尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

3.3 模型的不足 本實(shí)驗(yàn)是將大鼠的線栓法局灶腦缺血模型制備移植于小鼠身上。此模型中需凝斷頸外動(dòng)脈，雖然對(duì)神經(jīng)功能缺損的觀察并無影響，但與臨床的腦缺血病理模型有差距，有待進(jìn)一步改進(jìn)。

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