劉 卓，金 英，隋海娟

(遼寧醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧錦州 121001)

有些人認為AD樣癡呆是正常腦衰老的結(jié)果，皮質(zhì)失聯(lián)絡(luò)是其重要基礎(chǔ)。在20～100歲的正常衰老過程中，新皮質(zhì)突觸密度的下降趨向于(但未達到)AD發(fā)病的水平，如果出生時突觸有缺陷或缺少教育，將引起突觸過早下降到出現(xiàn)癡呆的水平。這種突觸喪失的影響可能比斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)大［1］。近年來研究發(fā)現(xiàn)AD患者早期即可出現(xiàn)突觸的喪失，其認知障礙程度與突觸結(jié)構(gòu)和功能的改變密切相關(guān)。突觸素(synaptophysin，SYP)是一種分子量為38 ku的糖蛋白，其在神經(jīng)元普遍表達，特異性的定位于軸突終末的突觸囊泡膜上，其密度和分布可間接反映體內(nèi)突觸的數(shù)量和分布情況［2］。有研究表明老年大鼠腦內(nèi)突觸素明顯降低，且突觸素丟失程度與記憶缺失程度成正相關(guān)［3］。

知母總皂苷(saponins from Anemarrhena asphodeloides Bge，SAaB)是從中藥知母中提取分離的有效成分，臨床及藥理研究表明:SAaB對老年性癡呆有一定的治療作用，能對抗老年性癡呆所導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶能力降低，但老年性癡呆是個綜合過程，涉及機體各個系統(tǒng)、不同結(jié)構(gòu)層次的多項指標。本研究采用自然衰老大鼠模型［4］進一步探討SAaB對海馬突觸相關(guān)蛋白—突觸素(SYP)和突觸后致密蛋白95(postsynaptic density protein 95，PSD95)表達的影響，為探討AD的發(fā)病機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 Sprague-Dawley(SD)大鼠，♂，老年大鼠(500～600 g，18 月)，青年大鼠(250 ～350 g，3 月)，由遼寧醫(yī)學(xué)院科學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK(遼)2003-0007;知母總皂苷(SAaB)，黃色粉末，純度＞80%，購自遼寧生物醫(yī)藥科技有限公司;鼠SYP單克隆抗體、兔PSD95多克隆抗體、山羊抗兔、山羊抗鼠二抗購自Santa Cruz公司;β-actin抗體購于Beyotime試劑公司。其他相關(guān)試劑由遼寧醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)實驗室提供。

1.2 動物分組及給藥方法 取18月齡SD大鼠24只，隨機分成 3 組:老年對照組，SAaB 100、200 mg·kg－1劑量組。另取3月齡SD大鼠8只，為青年對照組。SAaB組分別灌胃給予100、200 mg·kg－1SAaB，每天1次。各組大鼠飼養(yǎng)8周。

1.3 免疫組織化學(xué)染色檢測SYP、PSD95蛋白表達 飼養(yǎng)到期后，用10%水合氯醛(300 mg·kg－1)腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)頸總動脈持續(xù)灌注生理鹽水50 ml，然后再灌注4%多聚甲醛50 ml，取腦組織進行石蠟包埋，厚5 μm連續(xù)冠狀切片，每4張取1張，進行免疫組織化學(xué)染色觀察海馬SYP、PSD95蛋白表達的改變。免疫組織化學(xué)染色操作步驟按SABC免疫組化染色試劑盒操作說明進行。

1.4 Western蛋白印跡法檢測SYP、PSD95蛋白表達水平飼養(yǎng)到期后取大鼠海馬，提取總蛋白，用10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜，分別加一抗(一抗為1∶800稀釋)4℃過夜，二抗(1∶800稀釋)，放置化學(xué)發(fā)光凝膠系統(tǒng)分析儀中進行Ecl化學(xué)發(fā)光，測定SYP、PSD95。每個抗體測定時都進行β-肌動蛋白測定，以保證蛋白上樣量的一致性，利用Visionworks 6.3.3.圖像采集及分析軟件對蛋白帶進行分析，實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 SAaB對老年大鼠海馬SYP蛋白表達的影響 免疫組化結(jié)果顯示，與青年對照組相比，老年對照組大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)及齒狀回(dentate gyrus，DG)區(qū)SYP表達均明顯減少，呈顆粒狀或點狀，染色淺而稀疏。應(yīng)用SAaB 200 mg·kg－1的老年大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)及DG區(qū)SYP表達均明顯增加，但CA3增加最明顯，呈點片狀或顆粒狀，染色深而密集。

Western blot結(jié)果顯示，與青年對照組相比，老年對照組大鼠海馬SYP蛋白表達水平明顯降低。SAaB 100和200 mg·kg－1組大鼠海馬SYP蛋白表達水平較老年對照組明顯增加(Tab 1)，進一步說明SAaB能上調(diào)海馬SYP蛋白表達水平。

Tab 1 Effect of SAaB on SYP protein levels inrat hippocampus regions(±s，n=3)

Tab 1 Effect of SAaB on SYP protein levels inrat hippocampus regions(±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs young control;##P＜0.01 vs aged control

Group SYP protein expression levels(ASYP:Aβ-actin )Young control 1.886 ±0.082 Aged control 0.840 ±0.073＊＊SAaB 100 mg·kg－1 1.107 ±0.030##SAaB 200 mg·kg－1 1.607 ±0.019##

2.2 SAaB對老年大鼠海馬PSD95蛋白表達的影響 免疫組化結(jié)果顯示，與青年對照組相比，老年對照組大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)及齒狀回(DG)區(qū)PSD95表達均明顯減少，呈顆粒狀或點狀，染色淺而稀疏。應(yīng)用SAaB 200 mg·kg－1的老年大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)及DG區(qū)PSD95表達都增加，但CA3增加最明顯，呈顆粒狀，染色深而密集。

Western blot結(jié)果顯示，與青年對照組相比，老年對照組大鼠海馬PSD95蛋白表達水平明顯降低。SAaB 100和200 mg·kg－1組大鼠海馬PSD95蛋白表達水平較老年對照組明顯增加(Tab 2)，進一步說明SAaB能上調(diào)海馬PSD95蛋白表達水平。

Tab 2 Effect of SAaB on PSD95 protein levels in rathippocampus regions(±s，n=3)

Tab 2 Effect of SAaB on PSD95 protein levels in rathippocampus regions(±s，n=3)

＊＊P ＜0.01 vs young control;##P ＜0.01 vs aged control.

Group PSD95 protein expression levels(APSD95:Aβ-actin )Young control 1.164 ±0.041 Aged control 0.464 ±0.050＊＊SAaB 100 mg·kg－1 0.819 ±0.078##SAaB 200 mg·kg－1 1.113 ±0.050##

3 討論

海馬是學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵部位，并且對衰老極為易感［5］。突觸是神經(jīng)元信息傳遞的重要結(jié)果，有文獻報道，在衰老過程中海馬神經(jīng)元的突觸發(fā)生了明顯的變性改變。齒狀回顆粒層的突觸密度減少了24%，海馬錐體神經(jīng)元的突觸密度均明顯低于青年組［6］。SYP作為突觸前終末的特征性標記物，常用來檢測突觸的密度和分布，其數(shù)量減少提示突觸數(shù)量減少，突觸囊泡減少，進而影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，最終在行為上表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶障礙［7］。AD發(fā)病早期，突觸數(shù)量減少較神經(jīng)元喪失更明顯，還伴有突觸病理性變化［8］。通過提高SYP蛋白表達，提高功能性突觸的形成率和遞質(zhì)含量的釋放，可以拮抗老年性癡呆的病理發(fā)展。本實驗通過對老年大鼠海馬CA1、CA3和齒狀回區(qū)突觸素蛋白觀察和分析發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用SAaB的老年大鼠較對照組老年大鼠海馬突觸素蛋白表達明顯增加。這些結(jié)果說明:老年學(xué)習(xí)記憶減退與海馬突觸素的變化密切相關(guān)。而SAaB能夠明顯的增加海馬突觸相關(guān)蛋白的表達，這種作用機制可能與改變了突觸的可塑性有關(guān)。該研究為知母總皂苷改善學(xué)習(xí)記憶障礙提供了實驗依據(jù)。

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