劉衛(wèi)海，肖國(guó)麗，賴小平，趙愛國(guó)，2，3

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥開發(fā)研究中心，廣東廣州 510006;2.清遠(yuǎn)醫(yī)藥集團(tuán)，廣東清遠(yuǎn) 511518;3.東莞廣州中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥數(shù)理工程研究院，廣東東莞 523808)

中藥藤黃(gamboge)系藤黃科植物藤黃樹(Garcinia hanburyiHook.F.G)所分泌的干燥樹脂，近年來，藤黃的抗腫瘤作用受到高度關(guān)注。已有研究證實(shí)，新藤黃酸(neo-gambogic acid，NGA)為藤黃抗腫瘤作用的主要有效成分之一［1－3］。肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一［4］，同時(shí)也是第三大引起患者死亡的腫瘤［5］。為此，本實(shí)驗(yàn)探討了新藤黃酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，旨在為進(jìn)一步開發(fā)新藤黃酸提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物與細(xì)胞株 新藤黃酸(NGA):亮黃色粉末，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥開發(fā)研究中心制備，純度95.83%，批號(hào)20100304;人肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞株:購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。

1.2 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);AnnexinⅤ-FITC/PI apoptosis kit雙染試劑盒、Cell cycle strain solution細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(聯(lián)科生物公司)。

1.3 主要儀器 CO-150型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)NBS公司);CKX-41-32型倒置顯微鏡(日本 OLYMPUS公司);FC500型流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼－庫(kù)爾特公司，配有CXP2.0分析系統(tǒng))。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及給藥［6］人肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞株培養(yǎng)于體積分?jǐn)?shù)為0.10的胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置37℃，5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)，每24 h～48 h換液1次，常規(guī)消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。NGA溶于二甲基亞砜(DMSO)，給藥時(shí)用生理鹽水稀釋至所需濃度，DMSO的終濃度小于0.001(體積分?jǐn)?shù));對(duì)照組給相應(yīng)體積的溶媒，DMSO的終濃度為0.001(體積分?jǐn)?shù))。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡率及細(xì)胞周期 分別按AnnexinⅤ-FITC/PI apoptosis kit試劑盒說明書和Cell cycle strain solution細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說明書操作。

2.3 Western blot法檢測(cè)Bax和Bcl-2的表達(dá)水平 Western blot實(shí)驗(yàn)參照《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》［7］進(jìn)行。顯影，定影，拍照后，用NIH Image J軟件對(duì)照片進(jìn)行灰度分析，Bax蛋白和Bcl-2蛋白的含量用目的條帶灰度值與內(nèi)參βactin條帶灰度值的比值表示。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用SPSS11.5軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩組間均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析。

3 結(jié)果

3.1 NGA對(duì)HepG2細(xì)胞的早期凋亡率的影響 在流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限顯示活細(xì)胞，右下象限顯示早期凋亡細(xì)胞，右上象限顯示晚期凋亡及壞死細(xì)胞。NGA(2.0 mg·L－1)給藥后12 h～36 h，給藥組出現(xiàn)明顯的早期凋亡現(xiàn)象，給藥后48 h，大部分早期凋亡細(xì)胞轉(zhuǎn)變成晚期凋亡及壞死細(xì)胞(Tab 1)。

3.2 NGA對(duì) HepG2細(xì)胞周期的影響 NGA(2.0 mg·L－1)給藥后12 h～36 h，S期細(xì)胞明顯增多，給藥后 48 h，G0/G1期細(xì)胞明顯增多(Tab 2)。

3.3 NGA對(duì)HepG2細(xì)胞Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響經(jīng)NGA作用后，HepG2細(xì)胞的Bax蛋白表達(dá)隨NGA濃度增大逐漸增加，而Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸減少，Bax/Bcl-2比值升高(Tab 3)。

Tab 1 Effect of NGA on early apoptotic rate in HepG2 cell line(±s，n=3)

Tab 1 Effect of NGA on early apoptotic rate in HepG2 cell line(±s，n=3)

*P＜0.05 vs control

Treated time/h Apoptotic plus necrotic cell/%Early apoptotic cell/%12(control)0.09 ±0.07 2.50 ±0.88 12(treated) 0.86 ±0.29* 32.19 ±2.08*24(control) 0.12 ±0.04 4.16 ±1.21 24(treated) 2.25 ±0.23* 49.44 ±3.12*36(control) 0.22 ±0.13 5.12 ±1.93 36(treated) 31.66 ±4.25* 36.90 ±2.15*48(control) 4.49 ±1.12 14.96 ±2.13 48(treated) 70.85 ±5.02*9.90 ±1.01

Tab 2 Effect of NGA on cell cycle kinetics in HepG2 cell line(±s，n=3)

Tab 2 Effect of NGA on cell cycle kinetics in HepG2 cell line(±s，n=3)

*P＜0.05 vs control

Treated time/h Cell population in different phases/%G0/G1 S G2/M 12(control)77.949 ±4.711 7.285 ±1.048 14.766 ±2.663 12(treated) 69.074 ±7.221 21.094 ±5.036* 9.832 ±1.945*24(control) 71.767 ±8.625 6.893 ±1.946 21.340 ±5.266 24(treated) 70.733 ±6.256 25.447 ±3.371* 3.819 ±0.856*36(control) 71.283 ±9.172 8.542 ±2.863 20.175 ±2.817 36(treated) 71.585 ±8.662 24.426 ±3.225* 3.989 ±1.035*48(control) 64.165 ±5.261 8.667 ±2.359 27.168 ±6.387 48(treated) 83.743 ±6.898*8.464 ±2.083 7.793 ±2.651*

Tab 3 Effect of NGA on the expressionof Bax and Bcl-2 in HepG2 cell line(±s，n=3)

Tab 3 Effect of NGA on the expressionof Bax and Bcl-2 in HepG2 cell line(±s，n=3)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control

Group Concentration/mg·L－1 Bax Bcl-2 Bax/Bcl-2 value Control － 0.099 ±0.029 1.654 ±0.147 0.06 NGA 1.0 0.252 ±0.190* 0.871 ±0.237* 0.29*2.0 0.786 ±0.218* 0.349 ±0.199* 2.25＊＊3.0 1.035 ±0.289＊＊ 0.049 ±0.026＊＊ 21.14＊＊

4 討論

近年來的研究證明，很多抗腫瘤藥物均可引起腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到抗腫瘤療效，細(xì)胞凋亡也已被用來作為評(píng)價(jià)抗腫瘤藥物療效的指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在一定時(shí)間范圍(給藥后12 h～36 h)，給藥組的早期凋亡率均明顯高于對(duì)照組的早期凋亡率，據(jù)此可推斷在一定時(shí)間范圍NGA具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

細(xì)胞周期阻滯與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NGA在給藥后12 h～36 h，主要使細(xì)胞阻滯在S期(即DNA合成期)，其原因可能是NGA影響細(xì)胞DNA的合成及復(fù)制，引起DNA損傷，使細(xì)胞未能通過DNA損傷檢測(cè)點(diǎn)［8］。這有別于大多數(shù)抗腫瘤藥物將細(xì)胞阻滯在G1期［9］，其原因有待進(jìn)一步研究。

普遍認(rèn)為Bax和Bcl-2兩蛋白之間的比例關(guān)系是決定對(duì)細(xì)胞凋亡抑制作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素之一［10］。在細(xì)胞中，當(dāng)Bax表達(dá)量較高時(shí)，形成同源二聚體Bax/Bax，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，當(dāng)Bcl-2表達(dá)量較高時(shí)，形成異源二聚體Bcl-2/Bax，抑制細(xì)胞凋亡［11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)NGA作用后，HepG2細(xì)胞的Bax蛋白表達(dá)隨NGA濃度增大逐漸增加，而Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸減少，Bax/Bcl-2比值升高，Bax表達(dá)占主導(dǎo)，從而使細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的反應(yīng)增強(qiáng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

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