魯 珍，穆利霞，秦小明，劉 軍，鄒宇曉，廖森泰，*

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東廣州510610；2.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江 524088）

我國是養(yǎng)蠶大國，蠶蛹作為我國優(yōu)勢傳統(tǒng)行業(yè)-絲綢加工的主要副產(chǎn)物，每年可產(chǎn)幾十萬噸，干蠶蛹中粗蛋白含量高達60%～71.9%，還富含氨基酸等多種營養(yǎng)素，具有補充機體營養(yǎng)、促進生長發(fā)育、抗疲勞、抗衰老、提高人體免疫功能等多種功能，是一種比較理想的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)[1]。目前我國繅絲蠶蛹主要用作飼料。甚至被丟棄，綜合利用水平較低。蠶蛹蛋白生產(chǎn)技術(shù)的不足和產(chǎn)品本身的缺陷（如蠶蛹的腥臭味殘留）以及市場的推廣等問題，限制了它在食品、醫(yī)藥和工業(yè)等方面的應(yīng)用。因此，利用繅絲蠶蛹為原料，通過酶解制備呈味肽或呈味基料，對于提高蠶蛹蛋白的附加值具有很重要的意義。國內(nèi)外利用酶解低值蛋白資源并結(jié)合美拉德反應(yīng)制備呈味基料的研究很多[2-5]，但利用蠶蛹蛋白酶解制備呈味基料的研究還未有報道。本文通過研究單酶、復(fù)合酶（內(nèi)外切酶）水解蠶蛹蛋白的酶解特性，篩選出適合酶解蠶蛹蛋白制備富含呈味肽和呈味氨基酸的酶解方式，并通過美拉德反應(yīng)進行風(fēng)味改良，為蠶蛹蛋白制備富含呈味肽及呈味氨基酸調(diào)味料的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂蠶蛹粉 廣東翁源信達繭絲綢有限公司；Alcalase 2.4L（17.30×104U/g）、木瓜蛋白酶（5.50×104U/g）、風(fēng)味蛋白酶（1.88×104U/g）、胰蛋白酶（5.42×104U/g）、復(fù)合蛋白酶（5.71×104U/g） 諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；中性蛋白酶（6.01×104U/g） 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；其他試劑 均為分析純。

Mettler Toledo實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；SHZ-A水浴恒溫振蕩器 上海躍進醫(yī)療器械廠；UV-1800紫外分光光度計 島津；L-8900氨基酸分析儀 HITACHI；雷磁ZDY-500自動永停滴定儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Centrifuge-5702離心機 廣州市深華生物技術(shù)有限公司；恒溫振蕩器 常州澳華儀器有限公司；KDN-102C定氮儀 上海纖檢儀器有限公司。

表2 14種酶組合水解方案設(shè)計Table 2 Hydrolyzed program design of 14 kinds of enzyme combinnation

1.2 實驗方法

1.2.1 脫脂蠶蛹蛋白酶解液制備 脫脂蠶蛹粉（蛋白含量73%）（過50目篩）→添加一定pH的磷酸鹽緩沖溶液（0.2mol/L）→加酶恒溫振蕩酶解→沸水浴滅酶→4000r/min離心→取上清液冷凍處理

1.2.2 分析方法 水解度測定：pH-stat法[6]；總氮含量測定：采用凱氏定氮法；氨基氮測定：甲醛滴定法；總肽氮含量=酶解產(chǎn)物上清液總氮含量-酶解產(chǎn)物上清液氨基氮含量；總氨基酸含量測定方法：GB/T 5009.124-2003；蛋白質(zhì)回收率（%）=上清液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量/原料中蛋白的質(zhì)量×100；游離氨基酸分析[7]：取2mL酶解液，加入2mL質(zhì)量濃度為6g/100mL的5-磺基水楊酸，反應(yīng)1h后加入1mL 0.06mol/L HCl溶液及1mL 1g/100mL的EDTA-2Na溶液，充分混合，4800r/min離心10min。吸取2mL上述混合液，加入4mL pH=2.2的緩沖液，混合均勻，離心，過濾后直接上機測定。

游離氨基酸比例（%）=酶解液游離氨基酸含量/酶解液總氨基酸含量×100；

肽類氨基酸比例（%）=（酶解液總氨基酸含量-酶解液游離氨基酸含量）/酶解液總氨基酸含量×100[8]。

1.2.3 單酶酶解蠶蛹蛋白最優(yōu)條件的單因素實驗影響蛋白質(zhì)酶解的因素很多，比如酶的選擇及用量、蛋白質(zhì)的變性程度、溫度、pH、底物濃度及酶解時間等，適宜蛋白酶的選擇和酶解工藝參數(shù)的制定應(yīng)根據(jù)酶解產(chǎn)物的應(yīng)用目的確定。

本實驗的目的是獲得較高的水解度，因此酶的選擇及酶解條件至關(guān)重要?？紤]到各種酶（包括動物、植物、微生物來源的蛋白酶）的性價比及作用特點，實驗選擇了六種常用的蛋白酶，前期已通過研究pH、溫度、底物濃度、酶添加量等因素條件來確定不同蛋白酶酶解蠶蛹蛋白的最優(yōu)條件，結(jié)果如表1所示。

表1 不同蛋白酶酶解脫脂蠶蛹蛋白優(yōu)化條件Table 1 Optimal conditions of various commercial proteases to hydrolyze defatted silkworm pupa protein

1.2.4 蠶蛹蛋白復(fù)合酶解方案 將Alcalase 2.4L、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶這四種內(nèi)切酶與風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶這兩種內(nèi)外切酶組成8種復(fù)合酶酶解方式，以氨基氮含量為指標從中選擇較適合的酶解方式，并與六種單酶酶解液氨基氮含量結(jié)果進行比較分析。酶解方案見表2。

1.2.5 酶解液感官評價 感官評分：選取10個經(jīng)過嚴格培訓(xùn)的評定員組成感官鑒定小組，對蠶蛹酶解液的外觀和風(fēng)味進行綜合評價?？偡譂M分100分，外觀和風(fēng)味的評分根據(jù)各項指標所占的比例（25%、75%）的不同，計算最終得分。評分標準如表3所示。

表3 脫脂蠶蛹粉酶解液感官評分標準Table 3 Sensory score standard of defatted silkworm pupa powder enzymatic hydrolysate

1.2.6 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的制備 選擇酶解4h的酶解液，葡萄糖添加量6%，pH為7.5，溫度110℃，時間1h進行美拉德反應(yīng)。感官評定采用評分法由六位具有經(jīng)驗的評定員對反應(yīng)后的酶解液香氣濃郁強度指標進行評分，根據(jù)喜歡程度對產(chǎn)物進行評分（1～10分），并計算平均值進行比較以及方差分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用ANOVA法進行顯著性檢驗，p＜0.05為統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異。并采用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 六種蛋白酶酶解脫脂蠶蛹蛋白的最優(yōu)條件

表4 六種單酶酶解脫脂蠶蛹蛋白的酶解結(jié)果Table 4 Enzymatic results of six single-enzymatic hydrolysis of defatted silkworm pupa protein

由表4可知，堿性蛋白酶酶解蠶蛹蛋白在相同的水解時間里水解度是最高的，是一種深度水解的堿性內(nèi)切蛋白酶，可以水解谷氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、酪氨酸、賴氨酸和谷氨酰胺的羧端肽鍵[9]，Andamson等[10]研究發(fā)現(xiàn)，與胰蛋白酶釋放的肽段相比Alcalase 2.4L釋放的肽段更短而且產(chǎn)率更高。另外，Alcalase的價格較之來源于動物體內(nèi)的蛋白酶便宜且活性高，適于工業(yè)化生產(chǎn)使用。中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶的水解度次之。風(fēng)味蛋白酶酶解蠶蛹蛋白酶的水解度較低，因其酶活較低。有研究表明，風(fēng)味蛋白酶酶解制備小分子肽的肽得率相對于堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶等酶解工藝的肽得率較低，但風(fēng)味較好，腥味低，這是由于風(fēng)味蛋白酶還有端肽酶的特點，端肽酶可以不同程度的水解在酶解過程中產(chǎn)生的苦味肽，降低小分子肽酶解液的苦味[11]。

2.2 14種酶解方式氨態(tài)氮含量比較

各種酶解方式的氨態(tài)氮含量如圖1所示。

圖1 14種酶解方式的氨態(tài)氮含量比較Fig.1 Ammonia nitrogen content of 14 kinds of enzymatic way

圖1結(jié)果表明，不同酶解方式所得的氨基氮含量有不同程度的差異，部分存在顯著性差異（p＜0.05）。Alcalase 2.4L和風(fēng)味蛋白酶復(fù)合酶解液中氨基氮含量最高，達43.17mg/g，水解度最高；中性蛋白酶和風(fēng)味酶復(fù)合酶解液中氨基氮含量達40.25mg/g，水解度也較高。總體來說，復(fù)合酶解液的氨基氮含量和水解度較其對應(yīng)的單酶酶解液高，這表明內(nèi)外切酶同時作用于底物時，具有協(xié)同增效的作用，因此選用復(fù)合酶解有助于提高蠶蛹蛋白的利用率。

2.3 8種復(fù)合酶解方式的蛋白回收率及酶解液感官分值

表5 8種復(fù)合酶解方式蛋白回收率、酶解液感官分值Table 5 Protein recovery rate and sensory score of enzymatic hydrolysate by 8 composite enzymatic way

酶解過程中，根據(jù)單酶作用特點選用內(nèi)切酶和外切酶組合，能在一定程度上提高酶解液的風(fēng)味，而且能夠提高酶解效率，具有協(xié)同增效的作用[12]。由表5可知，復(fù)合酶解方式中Alcalase 2.4L和風(fēng)味酶復(fù)合酶解的蛋白回收率最高，可達67.7%。脫脂蠶蛹粉在胰酶與復(fù)合酶酶解液中總肽氮含量最高為53.24mg/g；其次是Alcalase 2.4L與復(fù)合酶酶解液為50.88mg/g；Alcalase 2.4L和風(fēng)味酶的作用下總肽氮含量也較高為47.13mg/g。

由酶解液的感官分值可知，胰酶與復(fù)合酶酶解液感官值較低，堿性酶Alcalase 2.4L和風(fēng)味酶復(fù)合酶解的酶解液感官評分結(jié)果最好，酶解液較澄清，刺鼻的氣味較淡，后味較鮮美，這是因為風(fēng)味蛋白酶制得的小分子肽風(fēng)味比較好，腥味低，而且能在一定程度上降低小分子肽酶解液的苦味。從外觀、色澤上來看，水解度高的酶解液顏色呈深紅色，澄清；水解度低的酶解液顏色呈橙黃色，較渾濁。崔春等[13]指出，水解度較低時酶解液無明顯風(fēng)味或以特征苦味為主，如果提高水解度會將大部分蛋白質(zhì)降解為氨基酸和小分子肽，酶解液會呈現(xiàn)出典型的鮮味，這和本研究的感官評價結(jié)果基本吻合。因此無論從水解度方面考慮，還是從蛋白回收率、總肽氮含量、酶解液感官評價來看，選擇Alcalase 2.4L和風(fēng)味酶組合的酶解方式最為合適。

2.4 酶解產(chǎn)物氨基酸分析

無論是傳統(tǒng)的調(diào)味品如醬類、黃酒、腐乳、肉湯、醬油還是現(xiàn)代調(diào)味品如蛋白抽提物、酵母抽提物、骨素等都含有一定量的肽，這些肽對它們風(fēng)味有著顯著的影響[14]。蛋白質(zhì)在酶水解作用下，最終變成小分子的短肽及游離氨基酸，短肽的味感與其氨基酸組成有關(guān)，富含鮮味氨基酸的短肽味感更佳[15]。本實驗對Alcalase 2.4L和風(fēng)味蛋白酶復(fù)合酶解方式制備的酶解液進行氨基酸組成分析，結(jié)果見表6。

由表6可見，酶解液中游離氨基酸占氨基酸總量的比例為50.26%，而肽類氨基酸占氨基酸總量的比例為49.74%，酶解液中肽類氨基酸的比例和游離氨基酸的比例各占一半。從各種類的氨基酸來分析，呈鮮、甜味的氨基酸（谷氨酸、天門冬氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸和丙氨酸）占總游離氨基酸含量的27.18%，以肽類形式存在的鮮甜味氨基酸占總肽類氨基酸含量的60.39%。酶解液的游離氨基酸中，亮氨酸的含量最高，酪氨酸次之，半胱氨酸的含量最低。另外酶解中鮮甜味氨基酸以游離氨基酸形式存在的比例為31.27%，以肽類氨基酸形式存在的比例為68.73%。

表6 酶解產(chǎn)物氨基酸分析Table 6 Amino analysis of the hydrolysate

同時，酶解液中的呈鮮甜味氨基酸的游離氨基酸含量均小于其呈味閾值，其在酶解液中的鮮甜味無法被感知，因此我們推測酶解液中呈味的組分主要是蛋白肽。有研究表明：小分子肽的感官特性與其氨基酸組成密切相關(guān)，其味感取決于其組成的氨基酸的原有味感[17]。肖如武等[18]認為酶解液呈鮮味的原因是蛋白酶解過程中含鮮甜味氨基酸的小分子肽造成的，產(chǎn)物主體為呈味肽。

2.5 美拉德反應(yīng)改善酶解液風(fēng)味

肽及氨基酸經(jīng)美拉德反應(yīng)后能夠明顯提升鮮味、醇厚感和后味，且雜味較少，口味純正[19]。本實驗所得酶解液均有不同程度的腥臭味，故而通過美拉德反應(yīng)對其風(fēng)味進行改良。實驗結(jié)果如圖2所示，結(jié)果的雙因素方差分析見表7。

圖2 不同酶解方式美拉德反應(yīng)感官評價分值比較Fig.2 Sensory evaluation of Maillard reaction from different enzymatic way

表7 無重復(fù)雙因素方差分析Table 7 No repeat of the double factor variance analysis

由圖2可以看出，在六種單酶中，Alcalase 2.4L和風(fēng)味蛋白酶復(fù)合酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物香氣最濃。這說明Alcalase 2.4L和風(fēng)味蛋白酶的組合酶解方式最有利于改良和制備風(fēng)味物質(zhì)?？傮w來說，復(fù)合酶酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的香氣要優(yōu)于單酶酶解液，但胰酶與風(fēng)味酶、胰酶與復(fù)合酶的復(fù)合酶解液美拉德產(chǎn)物后腥味較重。表7結(jié)果表明：評定員之間對實驗結(jié)果沒有顯著影響（p＞0.05）；不同酶解方式對實驗結(jié)果有極顯著影響（p＜0.01），表明實驗方法可行。因此，Alcalase 2.4L和風(fēng)味蛋白酶復(fù)合酶解是脫脂蠶蛹粉制備呈味基料的最佳酶解方式。

3 結(jié)論

3.1 復(fù)合酶解結(jié)果表明，Alcalase 2.4L和風(fēng)味蛋白酶復(fù)合酶解的效果最好，氨基氮含量、水解度、蛋白回收率都是最高的，總肽氮含量也較高，酶解液的感官評價結(jié)果也較好。

3.2 Alcalase 2.4L和風(fēng)味蛋白酶的酶解液經(jīng)美拉德增香后產(chǎn)物的香氣最濃，感官評價值最高，腥臭味基本掩蓋。

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