付曉燕，吳 茜，胡正浩，謝筆鈞，孫智達(dá)，*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)楚天學(xué)院食品與生物科技學(xué)院，湖北武漢 430205；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢 430070）

近年來，隨著人們對燕麥營養(yǎng)價值和生理功能的逐步認(rèn)識，燕麥的食用消費(fèi)量與日俱增，將有可能成為中國或世界的第三大主糧。燕麥不僅是谷物食品中最好的全價營養(yǎng)食品，也是良好的功能因子提取原料[1]。燕麥中富含多酚類物質(zhì)，包括各種酚酸、燕麥蒽酰胺和黃酮類化合物等，使其具有突出的抗氧化功能[2]。燕麥中的酚類物質(zhì)有3種存在形式：游離型的酚酸、可溶性酯以及與蛋白質(zhì)、糖等組成的不溶性化合物[3]。其中游離態(tài)的酚酸最少，絕大多數(shù)酚類化合物以不溶解的結(jié)合狀態(tài)存在，這給燕麥多酚的提取帶來了一定的困難。酚類物質(zhì)的提取方法有很多，最常用的方法是溶劑提取法，它不需要特殊的設(shè)備，操作簡單易行，但同時也存在處理時間長、提取效率低等缺點。因此出現(xiàn)了一些輔助提取的方法，如酶、超聲波、微波等輔助提取法[4]。酶輔助提取技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種重要提取技術(shù)，選用適當(dāng)?shù)拿?，可以通過酶反應(yīng)將影響提取的雜質(zhì)分解除去，加速有效成分的釋放，具有快速、高效、反應(yīng)條件溫和、專一性強(qiáng)等諸多優(yōu)點，已越來越廣泛應(yīng)用于動植物原料中有效成分的提取[5-6]。對于燕麥多酚的提取來說，目前普遍采用的是溶劑提取法和堿水解法，關(guān)于酶法提取燕麥多酚的研究還非常有限。本研究在傳統(tǒng)溶劑提取法的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對酶輔助提取燕麥多酚的工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在建立一種可行的有助于提取結(jié)合多酚的方法，為燕麥多酚的利用提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

晉燕八號裸燕麥（脫殼） 山西省農(nóng)科院高寒區(qū)作物研究所提供；Folin-Ciocalteau試劑、DPPH自由基Sigma公司；乙醇、沒食子酸、碳酸鈉 均為分析純；中溫α-淀粉酶（8×103U/mL） 杰諾生物酶有限公司；木瓜蛋白酶（8×105U/g） 南寧龐博生物工程有限公司。

AC 210S電子天平 美國Sartorius Instrument Ltd；SHZ-82A恒溫水浴振蕩器 國華儀器廠；RE111型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Buchi公司；755B分光光度計 上海精制科學(xué)儀器廠；TDL-5離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 燕麥多酚的傳統(tǒng)溶劑提取工藝 準(zhǔn)確稱取5g燕麥粉于帶塞三角瓶中，按一定料液比加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，置于水浴搖床中在一定溫度下浸提一定時間，提取結(jié)束后抽濾，將提取液經(jīng)濃縮、定容后，10000r/min離心10min，待測。

1.2.2 傳統(tǒng)溶劑提取工藝最優(yōu)參數(shù)的確定 依次改變乙醇體積分?jǐn)?shù)（30%、50%、70%、80%、100%）、料液比（1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40）、水浴溫度（30、40、50、60、70、80℃）和浸提時間（0.5、1、2、3、4h），以燕麥多酚提取含量為評價指標(biāo)進(jìn)行單因素實驗，在單因素實驗基礎(chǔ)上，設(shè)計四因素三水平正交實驗，確定傳統(tǒng)溶劑法提取燕麥多酚的最佳工藝，因素水平表見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.3 燕麥多酚的酶輔助提取工藝 整個工藝分為兩個部分：酶解和浸提。準(zhǔn)確稱取2g燕麥粉于帶塞三角瓶中，加入一定量的木瓜蛋白酶、一定量的α-淀粉酶和20mL蒸餾水，置于水浴搖床中在一定溫度下酶解一定時間，酶解結(jié)束后用乙醇溶液浸提，浸提工藝同溶劑提取法最佳工藝條件。

1.2.4 酶輔助提取工藝最優(yōu)參數(shù)的確定 以燕麥多酚提取含量為評價指標(biāo)，依次改變木瓜蛋白酶添加量（0、0.5、2、4、6、10mg/g）、α-淀粉酶添加量（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0mL/g）、酶解溫度（50、60、70、80、90℃）和酶解時間（0.5、1、1.5、2、3h），根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)曲面正交實驗，確定酶輔助提取燕麥多酚的最佳酶解工藝，因素水平表見表2。

表2 響應(yīng)面實驗因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface test

1.2.5 總酚含量的測定 采用Folin-Ciocalteau法[7]。

1.2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 分別吸取100、200、300、400、500mg/L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1mL，依次加入6mL蒸餾水，0.5mL Folin-Ciocalteau試劑，混勻后加入20%的Na2CO3溶液1.5mL，充分混勻，定容10mL，在室溫下靜置1h后于765nm下測定其吸光度，以溶液濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，得回歸方程為：y=0.0011x+0.008，R2=0.9999。

1.2.5.2 樣品的測定 準(zhǔn)確吸取待測液0.1mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測液中總酚的沒食子酸當(dāng)量，并計算提取的總酚含量（mg/g），公式如下：

總酚含量（mg/g）=提取液中總酚濃度（mg/L）×定容體積（L）/取樣量（g）

2 結(jié)果與分析

2.1 傳統(tǒng)溶劑提取法單因素實驗

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響 考慮到與其他有機(jī)溶劑相比，乙醇安全性高，適宜于工業(yè)化生產(chǎn)，因此選用乙醇作為提取溶劑。分別采用體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%、80%和100%的乙醇溶液按料液比1∶20（W/V）于40℃水浴搖床中浸提2h，總酚提取含量見圖1。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對燕麥提取總酚含量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction content of oat phenols

由圖1可以看出，適當(dāng)增加乙醇的體積分?jǐn)?shù)會使總酚提取含量提高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時提取效果最好，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大，總酚提取含量顯著下降。表明80%乙醇溶液與燕麥酚類物質(zhì)的極性最為接近，可作為較適宜的提取溶劑。

2.1.2 料液比的影響 采用體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液分別按料液比1∶5、1∶10、1∶20、1∶30和1∶40（W/V）于40℃水浴搖床中浸提2h，總酚提取含量見圖2。

圖2 料液比對燕麥提取總酚含量的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction content of oat phenols

由圖2可以看出，隨著料液比逐漸增大，總酚提取含量逐漸提高，當(dāng)料液比達(dá)到1∶20時，繼續(xù)增大液料比，提取含量增長趨勢逐漸變緩，當(dāng)料液比超過1∶30后，提取含量基本沒有變化，但是料液比增加給后處理工序帶來困難，因此綜合考慮提取效果、溶劑用量和能量損耗，選擇料液比1∶20為宜。

2.1.3 水浴溫度的影響 采用體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液按料液比1∶20（W/V）分別在30、40、50、60、70和80℃水浴搖床中浸提2h，總酚提取含量見圖3。

圖3 水浴溫度對燕麥提取總酚含量的影響Fig.3 Effect of bath temperature on the extraction content of oat phenols

由圖3可以看出，在實驗溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的提高，總酚提取含量先上升后下降，在50℃達(dá)到最佳。這是因為隨著溫度的上升，分子運(yùn)動速度加快，有利于多酚的溶出，但酚類物質(zhì)在高溫下長時間受熱會遭到一定程度的破壞，提取含量反而下降，因此對燕麥多酚來說水浴溫度50℃左右較為合適。

2.1.4 浸提時間的影響 采用體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液按料液比1∶20（W/V）于50℃水浴搖床中分別浸提0.5、1、2、3和4h，總酚提取率見圖4。

圖4 浸提時間對燕麥提取總酚含量的影響Fig.4 Effect of extraction time on the extraction content of oat phenols

由圖4可以看出，燕麥總酚提取含量在2h左右達(dá)到最高，提取時間過短，多酚來不及溶出，提取時間過長則會因為溫度的影響發(fā)生分解，提取率趨于下降，同時時間延長也增加了成本和消耗，故最佳浸提時間為2h左右。

2.2 傳統(tǒng)溶劑提取法正交實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，設(shè)計四因素三水平的正交實驗來進(jìn)一步優(yōu)化提取條件，以總酚提取含量（mg/g）為指標(biāo)，正交實驗結(jié)果見表3。

由表3可以看出，對燕麥多酚的提取效果影響最為顯著的因素是乙醇體積分?jǐn)?shù)，其次是浸提時間和水浴溫度，料液比對提取效果的影響最小。根據(jù)k值的大小確定燕麥多酚的較優(yōu)提取條件為A2B3C2D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，料液比為1∶40（W/V），水浴溫度50℃，浸提時間2h。但料液比的k2和k3非常接近，綜合考慮實驗效率、節(jié)約資源等因素，選擇料液比1∶20為最佳。

在上述條件下進(jìn)行提取驗證實驗，3次實驗結(jié)果得到燕麥總酚平均提取含量為0.817mg/g，明顯低于李巨秀等[8]報道的6.42g/kg。由于本研究以脫殼后的燕麥籽粒作為實驗對象，而燕麥酚類成分多與燕麥麩皮中的細(xì)胞壁多糖成分鍵合在一起，因此對比麩皮和脫殼燕麥粉中的酚類物質(zhì)，脫殼燕麥粉中的酚類物質(zhì)要低得多。

表3 正交實驗設(shè)計及結(jié)果分析Table 3 Orthogonal test design and result analysis

2.3 酶輔助提取法單因素實驗

2.3.1 蛋白酶添加量的影響 蛋白酶添加量分別為0、0.5、2、4、6、10mg/g，酶解溫度為50℃，酶解時間為1h時，總酚提取含量見圖5。

圖5 蛋白酶添加量對提取總酚含量的影響Fig.5 Effect of papain addition on the extraction content of oat phenols

由圖5可知，在蛋白酶添加量達(dá)到4mg/g之前，隨著酶用量的增加，總酚提取含量基本呈直線上升，當(dāng)添加量大于4mg/g之后，增長趨勢逐漸變緩。這是因為在較低的酶濃度下，蛋白質(zhì)底物能夠與酶充分結(jié)合，但將酶濃度提高到一定程度后，底物不能再對酶達(dá)到飽和，因而目標(biāo)成分的浸出率也不會有較大程度的提高[9]。綜合考慮總酚提取含量與成本問題，對燕麥多酚來說，蛋白酶添加量4mg/g即可。

2.3.2 淀粉酶添加量的影響 淀粉酶添加量分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0mL/g，酶解溫度為50℃，酶解時間為1h時，總酚提取含量見圖6。

圖6 淀粉酶添加量對提取總酚含量的影響Fig.6 Effect of α-amylase addition on the extraction content of oat phenols

由圖6可知，當(dāng)?shù)矸勖柑砑恿繛?.8mL/g時，總酚提取含量基本已經(jīng)達(dá)到最大值，隨著加酶量進(jìn)一步增大，提取含量基本持平，故淀粉酶添加量0.8mL/g較為適宜。

2.3.3 酶解溫度的影響 蛋白酶添加量為4mg/g，淀粉酶添加量為0.8mL/g，酶解溫度分別為50、60、70、80、90℃，酶解時間為1h時，總酚提取含量見圖7。

圖7 酶解溫度對提取總酚含量的影響Fig.7 Effect of enzymatic hydrolyzing temperature on the extraction content of oat phenols

由圖7可知，在實驗溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的提高，總酚提取含量先上升后下降，在70℃達(dá)到最佳。所添加的木瓜蛋白酶最適作用溫度范圍為55～60℃，但其耐熱性強(qiáng)，90℃時也不會完全失活[10]，而中溫淀粉酶通常在70～80℃活性最高。當(dāng)反應(yīng)體系溫度為70℃時，兩種酶解作用達(dá)到了一種動態(tài)平衡，繼續(xù)提高反應(yīng)體系溫度，酶活性開始降低，同時多酚結(jié)構(gòu)也遭到破壞，因而總酚提取含量明顯下降。

2.3.4 酶解時間的影響 蛋白酶添加量為4mg/g，淀粉酶添加量為0.8mL/g，酶解溫度為70℃，酶解時間分別為0.5、1、1.5、2、3h時，總酚提取含量見圖8。

圖8 酶解時間對提取總酚含量的影響Fig.8 Effect of enzymatic hydrolyzing time on the extraction content of oat phenols

由圖8可知，適當(dāng)延長酶解時間，酶解作用逐漸增大，總酚提取含量提高，但酶解1.5h后，進(jìn)一步延長時間，提取含量趨于下降。這可能是由于隨著時間的延長，酶解產(chǎn)物在溶液中的濃度不斷提高，對酶促反應(yīng)造成了抑制[9]，故酶解時間不應(yīng)過長，以1.5h左右為宜。

2.4 酶輔助提取法響應(yīng)面實驗

在單因素實驗基礎(chǔ)上，根據(jù)響應(yīng)面正交組合設(shè)計原則，采用四因素三水平響應(yīng)面分析方法對酶輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，實驗結(jié)果見表4。

利用Design-Expert 8.0.1軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到蛋白酶添加量（A）、淀粉酶添加量（B）、酶解溫度（C）和酶解時間（D）的二次多項回歸方程：總酚提取含量＝2.13＋0.17A＋0.16B＋0.027C＋5.667×10-3D－3.750×10-3AB＋0.067AC－0.026AD－0.013BC＋4.397×10-4BD－7.112×10-3CD－0.17A2－0.21B2－0.20C2－0.14D2

表4 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Design and result of response surface test

總酚提取含量實驗值與回歸方程預(yù)測值的相關(guān)系數(shù)R2＝0.9948，表明擬合程度良好，回歸方程模型可行。二次多項式方程在統(tǒng)計學(xué)上的意義由F檢驗確定，p值越小，則其相應(yīng)變量的顯著性越高[11]。由表5可知，回歸模型p＜0.0001，表明二次多元回歸模型極其顯著；失擬項p＝0.1011＞0.05，模擬失擬不顯著，說明模型適當(dāng)；模擬的調(diào)整確定系數(shù)Radj2＝0.9896，說明該模型能解釋98.96%響應(yīng)值的變化，因而該模型擬合程度較好，實驗誤差小，可以用來對酶法輔助提取燕麥多酚的工藝結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測，具有一定的實際應(yīng)用價值。

由表5可以看出，回歸方程的一次項中A、B、C極顯著，D不顯著，二次項均極顯著。從F值看出四個因素對總酚提取率的影響大小順序為A＞B＞C＞D，即對提取含量影響最大的因素是蛋白酶添加量，其次是淀粉酶添加量，酶解時間對提取含量的影響最小。交互項中AC在0.01水平上顯著，AD在0.05水平上顯著，AB、BC、BD、CD不顯著，說明蛋白酶添加量與酶解溫度和酶解時間的交互作用明顯（見圖9），尤其是與酶解溫度的交互作用達(dá)到極顯著水平。

結(jié)合回歸數(shù)學(xué)模型分析，取回歸方程一階偏導(dǎo)數(shù)為零，計算出酶輔助提取燕麥多酚的最優(yōu)工藝參數(shù)為：蛋白酶添加量5.07mg/g，淀粉酶添加量0.88mL/g，酶解溫度72.99℃，酶解時間1.23h，在此工藝條件下，預(yù)測燕麥多酚提取含量為2.204mg/g。

表5 回歸模型方差分析表Table 5 Analysis of variance for response surface quadratic model

圖9 響應(yīng)曲面圖Fig.9 Response surface

為進(jìn)一步驗證模型的有效性，根據(jù)上述實驗結(jié)果進(jìn)行了近似驗證實驗，考慮到實際操作的便利，將最優(yōu)條件調(diào)整為：蛋白酶添加量5.0mg/g，淀粉酶添加量0.9mL/g，酶解溫度73℃，酶解時間1.2h，在此條件下3次驗證實驗所得燕麥多酚平均提取含量為2.169mg/g，可見實驗值和預(yù)測值之間有較好的擬合性，證明采用該酶解工藝來提取燕麥多酚是可行的。同時，該提取率明顯高于傳統(tǒng)溶劑法對燕麥多酚的提取含量0.817mg/g，說明經(jīng)過酶解作用后燕麥多酚更有利于提取。

3 結(jié)論

對傳統(tǒng)溶劑法提取燕麥多酚影響最大的因素是乙醇體積分?jǐn)?shù)，然后依次是浸提時間、水浴溫度和料液比，最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，料液比1∶20，水浴溫度50℃，浸提時間2h。在此條件下燕麥多酚平均提取含量為0.817mg/g。

對酶輔助提取燕麥多酚影響最大的因素是蛋白酶添加量，其次是淀粉酶添加量和酶解溫度，酶解時間對提取率的影響最小。最佳酶解工藝條件為：蛋白酶添加量5.0mg/g，淀粉酶添加量0.9mL/g，酶解溫度73℃，酶解時間1.2h。在此條件下燕麥多酚平均提取含量為2.169mg/g。

酶輔助提取法作為一種快速、高效的提取方法，將燕麥多酚提取率明顯提高，具有一定的實際應(yīng)用價值。本研究初步建立了酶輔助提取燕麥多酚的方法，但酶解反應(yīng)的最適條件還有待進(jìn)一步優(yōu)化，如采用蛋白酶與淀粉酶分步酶解反應(yīng)，研究酶解液及浸提液的pH對浸提效果的影響等，有望進(jìn)一步提高燕麥多酚的提取含量。

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