徐紅云，王占斌

（東北林業(yè)大學林學院，黑龍江哈爾濱 150040）

粗毛纖孔菌[Inonotus hispidus（Bull.）P.Karst]隸屬于擔子菌門（Basidiomycota），擔子菌綱（Basidiomycetes），傘菌亞綱（Agaricomycetidae），刺革菌目（Hymenochaetales），刺革菌科（Hymenochaetaceae），纖孔菌屬（Inonotus），是一種十分珍貴的藥用真菌[1]。在民間常用于治療各種疾病，如在中國東北用于治療消化不良等胃病[2]，在新疆南部主要用該菌的煎劑治療各種癌癥、糖尿病、痛風、關節(jié)炎等[2]，在加拿大也曾經報道過其藥用價值[3]。藥用真菌含有各種生物活性物質如生物堿、糖及多糖、甾醇及萜類、皂苷、酚類及鞣質、有機酸、強心苷、揮發(fā)油、蛋白質、氨基酸和多肽等成分。目前國內外對于粗毛纖孔孔菌的生物活性物質研究較少，楊修鎮(zhèn)[4]從中分離出麥角淄醇，王占斌[5]研究發(fā)現其子實體多糖具有提高小鼠免疫功能的作用，而對于粗毛纖孔菌三萜類物質的研究幾乎沒有。三萜類化合物是廣泛存在于自然界的一類有機化合物，真菌在發(fā)酵過程中易產生三萜類物質，如Nakamura[6]從樺褐孔菌種中分離羊毛甾烷型inoterpenes A-F；靈芝中含有豐富的靈芝酸[7]；樟芝中含有較多的zhankuicA、B、C等麥角甾烷結構和zhankuicacid D、E等羊毛甾烷兩大結構物質[8]等，其中分離出的很多三萜類物質具有一定的生物活性，如抗炎活性、抗菌活性和抗腫瘤活性等[9]。本文以粗毛纖孔菌總三萜產量為指標，對其液體發(fā)酵培養(yǎng)基及搖瓶發(fā)酵條件進行優(yōu)化，從而對進一步大規(guī)模生產粗毛纖孔菌及提取有效三萜類物質，研究其藥用價值奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粗毛纖孔菌（IH-69） 東北林業(yè)大學森林保護實驗室分離保存。

超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；ZPQ-400智能氣候培養(yǎng)箱 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；Ultrospec 4300pro紫外/可見分光光度計 Amersham公司；STRATOS高速冷凍離心機 Kendro；高壓滅菌鍋 日本SANYO；恒溫水浴箱 上海森信實驗儀器有限公司；電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；XT 220A電子天平 Precisa公司。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 菌種活化 將4℃保存下的斜面菌種于PDA培養(yǎng)基上活化后，用打孔器均勻截取直徑為12mm的菌絲塊接種于厚度均勻的PDA平板上，28℃培養(yǎng)，再次活化10d；然后再用打孔器均勻截取直徑為12mm的菌絲片3片接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中。

1.2.2 篩選培養(yǎng)基 碳源篩選：3g/L蛋白胨、1.0g/L MgSO4·7H2O、2.0g/L KH2PO4、0.05g/L VB1，pH自然，分別以20g/L葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘露醇和乳糖為碳源，以不加碳源的培養(yǎng)基為對照。

氮源篩選：20g/L葡萄糖、1.0g/L MgSO4·7H2O、2.0g/L KH2PO4、0.05g/L VB1，pH自然，分別以3g/L蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、黃豆粉、硫酸銨和硝酸銨為氮源，以不加氮源的培養(yǎng)基為對照。

無機鹽篩選：20g/L葡萄糖、3g/L黃豆粉、0.05g/L VB1，pH自然，分別以3g/L MgSO4·7H2O、CaCl2、KH2PO4、FeSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O 和 1.0g/L MgSO4·7H2O 加2.0g/L KH2PO4為無機鹽，以不加無機鹽為對照。

維生素篩選：20g/L葡萄糖、3g/L黃豆粉、1.0g/L MgSO4·7H2O、2.0g/L KH2PO4，pH自然。分別以0.05g/L VB1、煙酸和VB6為維生素，以不加維生素為對照。

1.2.3 正交實驗設計 本實驗綜合1.2.2的單項實驗結果，選出最佳的碳源葡萄糖，最佳氮源黃豆粉，最佳無機鹽MgSO4·7H2O和KH2PO4及最佳維生素VB1作為參考因子，進行4因素3水平L9（34）的正交實驗（見表1），每種培養(yǎng)基設3個重復。

表1 正交實驗因素和水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng) 在裝液量為100mL/250mL的三角瓶中，接種量為3片，155r/min，27℃，pH自然的條件下培養(yǎng)10d。每次實驗重復三次。

1.3 菌絲生物量的測定

發(fā)酵結束后將培養(yǎng)液用紗布過濾，菌絲體用蒸餾水洗滌數次后在70℃的烘箱中烘干至恒重[10]，精確稱量菌絲干重。

1.4 胞內總三萜含量的測定

粗毛纖孔菌總三萜含量的測定用香草醛-冰醋酸-高氯酸分光光度比色法。

1.4.1 標準曲線 準確稱取白樺脂醇標準品5mg，溶于50mL無水乙醇，混合均勻得標準溶液（100μg/mL）。吸取標準溶液0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL，分別置于5mL容量瓶中，在100℃水浴上蒸干后加入0.20mL新制的5%香草醛-冰乙酸溶液和0.80mL高氯酸搖勻，于70℃水浴保溫反應15min后流水冷卻至室溫，再加入乙酸乙酯定量到5mL，搖勻，同時作試劑空白。在551nm處以試劑空白為參比，用1cm比色皿測定體系吸光度（OD值）。以白樺脂醇的微克數為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為y=0.009x＋0.0068，R2=0.9992。

1.4.2 菌絲總三萜含量的測定 將干燥的粗毛纖孔菌菌絲粉碎，取100mg粉末用5mL 75%的乙醇于70℃水浴鍋中浸提2h，浸提液離心后取0.1mL于5mL容量瓶中，100℃水浴蒸干后比色測定。根據標準曲線計算胞內總三萜產量，得計算公式如下：

式中，TD為胞內總三萜產量，mg/100mL；Y為測定的吸光值；G為提取液稀釋倍數；m為培養(yǎng)菌絲干重，g/100mL。

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)基成分對粗毛纖孔菌胞內總三萜產量的影響

2.1.1 碳源的篩選 碳源是構成細胞的結構物質，同時供給真菌生長繁殖所需要的能量及其代謝的調節(jié)物質，真菌能利用的碳源范圍較為廣泛，包括單糖、雙糖、多糖和醇類等[9]。從圖1可知，使用不同類型的碳源，粗毛纖孔菌的菌絲體干重、三萜含量及三萜產量均存在顯著性差異（p＜0.05）。當使用葡萄糖作為碳源時，粗毛纖孔菌的菌絲體干重和總三萜產量均較高，分別為0.75g/100mL和21.07mg/100mL；用蔗糖進行誘導時，三萜的含量最高為32.4mg/g；而粗毛纖孔菌對淀粉、甘露醇和乳糖的利用較差，其菌絲體干重和三萜產量均較低。以高產量的三萜類物質為標準，所以選擇葡萄糖作為最佳碳源。

圖1 不同碳源對粗毛纖孔菌菌絲體干重和三萜含量、產量的影響Fig.1 Effect of carbon source on mycelium dry weight and triterpenoid content，production of inonotus hispidus

圖2 不同氮源對粗毛纖孔菌菌絲體干重和三萜含量、產量的影響Fig.2 Effect of nitrogen source on mycelium dry weight and triterpene content，production of inonotus hispidus

2.1.2 氮源的篩選 氮源是構成真菌菌體蛋白質、核酸及酶類的主要成分，因此對其需求量也較大。從圖2可以看出，粗毛纖孔菌對不同氮源的利用存在明顯差異（p＜0.05），且對有機氮源的利用明顯高于無機氮源。以黃豆粉作為氮源時，粗毛纖孔菌菌絲體干重，三萜含量和三萜產量均最高，分別為1.21g/100mL、27.5mg/g和33.21mg/100mL；其次為牛肉膏、蛋白胨和酵母粉，對硝酸銨和硫酸銨的利用均較低。且經硝酸銨和硫酸銨誘導后的粗毛纖孔菌三萜含量及產量均低于不添加氮源培養(yǎng)基，說明無機態(tài)氮源對三萜類物質的代謝起一定抑制作用。本實驗以粗毛纖孔菌的三萜產量為標準，所以確定黃豆粉為后續(xù)實驗的最佳氮源。

2.1.3 無機鹽的篩選 無機離子可作為真菌中多種酶的輔因子，具有穩(wěn)定細胞質膜的作用，有些能夠調節(jié)細胞滲透壓和膨脹壓，參與各種能量反應，對真菌的生長和代謝起重要作用。從圖3可知，當使用MgSO4·7H2O和KH2PO4兩種無機鹽共同培養(yǎng)時，菌絲體的生物量最大，并且總三萜產量為36.02mg/100mL。以不添加無機鹽為對照，發(fā)現CaCl2、KH2PO4、FeSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O對粗毛纖孔菌的菌絲體干重和總三萜產量均有一定的抑制作用，可能無機鹽添加濃度偏高，抑制菌絲體的生長和三萜產物的代謝，所以以培養(yǎng)基中添加MgSO4·7H2O和KH2PO4兩種無機鹽作為最佳篩選結果。

圖3 不同無機鹽對粗毛纖孔菌菌絲體干重和三萜含量、產量的影響Fig.3 Effect of inorganic salt on mycelium dry weight and triterpene content，production of inonotus hispidus

圖4 不同維生素對粗毛纖孔菌菌絲體干重和三萜含量、產量的影響Fig.4 Effect of vitamin on mycelium dry weight and triterpene content，production of inonotus hispidus

2.1.4 維生素的篩選 維生素是真菌代謝必不可少的，且屬于不能用簡單碳源或氮源代替的有機物，一般其需求量較少。從圖4可以看出，維生素B1、煙酸和維生素B6對粗毛纖孔菌的生長存在顯著性差異（p＜0.05），而對三萜含量無顯著性影響（p＞0.05），取值范圍在27.31～29.11mg/g。當培養(yǎng)基中添加VB1時效果較好，菌絲體干重達1.26g/100mL，總三萜產量達34.57mg/100mL，綜合考慮確定以VB1作為最佳的維生素。

2.2 培養(yǎng)基成分正交實驗

根據單因素的篩選結果，選擇葡萄糖、黃豆粉、無機鹽MgSO4·7H2O和KH2PO4及VB1作為參考因子，進行4因素3水平L9（34）的正交實驗，以確定各營養(yǎng)物質的最佳用量，實驗結果見表2。

表2 L9（34）正交實驗結果Table 2Results of L9（34）orthogonal experiment

由表2可以看出各因素對粗毛纖孔菌菌絲生物量的影響主次順序為A＞C＞D＞B，對其胞內總三萜產量的影響主次順序為A＞C＞B＞D，根據粗毛纖孔菌菌絲生物量篩選的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組合是A3B2C3D1，根據胞內三萜產量的篩選的最佳組合是A3B3C3D3。一般菌絲生物量高，胞內總三萜產量就較高[11]，但通過組合實驗驗證A3B2C3D1組合的產量為67.337mg/100mL，A3B3C3D3組合的產量僅為65.259mg/100mL，所以最終選擇A3B2C3D1組合較好，即確定最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基為A3B2C3D1，即葡萄糖40g/L、黃豆粉5g/L、硫酸鎂1.5g/L、磷酸二氫鉀3g/L和維生素B10.05g/L。

2.3 搖瓶發(fā)酵條件對粗毛纖孔菌胞內總三萜產量的影響

2.3.1 接種量對胞內總三萜產量的影響 在最佳配比培養(yǎng)液中，選擇接種量為1、2、3、4、5、6片進行實驗，每個實驗重復3次，取平均值，結果如圖5所示。由圖5結果可知，不同接種量對粗毛纖孔菌的生物量，三萜含量及三萜產量存在顯著性影響。隨著接種量的增加，粗毛纖孔菌菌絲生物量和總三萜產量呈上升趨勢，接種量為5片時，菌絲體干重最高為2.50g/100mL；接種量為3片時，胞內三萜含量和三萜產量均較高，分別為39.6mg/g和82.95mg/100mL。接種量多于5片時，菌絲干體重和三萜產量均呈下降趨勢，說明接種量過多時，營養(yǎng)競爭激烈抑制菌絲生長。以胞內總三萜產量為目標，因此確定最佳接種量為3片。

圖5 接種量對粗毛纖孔菌菌絲體干重和三萜含量、產量的影響Fig.5 Effect of inoculation volume on mycelium dry weight and triterpene content，production of inonotus hispidus

2.3.2 搖瓶裝液量對胞內總三萜產量的影響 裝液量的多少直接影響微生物的供養(yǎng)及發(fā)酵微環(huán)境，過少則通氣量太大，菌絲生長緩慢；過多則通氣量太少，菌絲生長受限緩慢。本文選擇250mL三角瓶裝液量分別為60、80、100、120、140、160mL，在接種量為3片，pH為6，搖床轉速為155r/min，27℃的條件下培養(yǎng)10d。結果如圖6所示，裝液量低于100mL和高于140mL時，菌絲體干重和三萜產量均較低，而當搖瓶裝液量為100～140mL時，粗毛纖孔菌的生長及三萜的代謝相對較高且較平穩(wěn)。裝液量為100mL/250mL時，三萜產量高達81.06mg/100mL，以節(jié)約成本的角度來看，確定裝液量為100mL/250mL。

圖6 搖瓶裝液量對粗毛纖孔菌菌絲體干重和三萜含量、產量的影響Fig.6 Effect of liquid volume on mycelium dry weight and triterpene content，production of inonotus hispidus

2.3.3 pH對胞內總三萜產量的影響 發(fā)酵培養(yǎng)基的酸堿度影響藥用真菌細胞膜的功能、細胞形態(tài)和結構、無機鹽的溶解性、底物的利用速率、生物量和代謝產物的合成[12]。本文調節(jié)液體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為3、4、5、6、7、8，在裝液量為100mL/250mL，接種量為3片，155r/min，27℃的條件下培養(yǎng)10d。從圖7可知，培養(yǎng)基初始pH的大小對粗毛纖孔菌菌絲體生物量、胞內三萜含量和三萜產量均存在顯著性差異（p＜0.05），中性偏堿或偏酸環(huán)境對菌絲體的生長和三萜類物質的代謝起一定抑制作用。當pH為6時菌絲體干重、胞內三萜含量和三萜產量均達到最高值分別為2.41g/100mL、39.56mg/g和95.19mg/100mL，之后隨著pH的升高，菌絲生物量和總三萜產量急劇下降，因此以pH為6作為液體發(fā)酵培養(yǎng)基最佳pH。

圖7 pH對粗毛纖孔菌菌絲體干重和三萜含量、產量的影響Fig.7 Effect of pH value on mycelium dry weight and triterpene content，production of inonotus hispidus

2.3.4 發(fā)酵時間對胞內總三萜產量的影響 發(fā)酵培養(yǎng)時間影響菌絲體的生長及代謝產物的釋放，時間過短菌絲生長慢，代謝產物還未及時釋放，時間過長易造成菌體自溶，有害物質的代謝等。所以選擇裝液量為100mL/250mL三角瓶，在接種量為3片，pH為6，搖床轉速為155r/min，27℃的條件下分別培養(yǎng)7、8、9、10、11、12、13d，結果如圖8所示，隨著發(fā)酵時間的延長，粗毛纖孔菌菌絲體干重、胞內三萜含量及胞內三萜產量均呈現先遞增后降低的趨勢。當培養(yǎng)時間達到11d時，菌絲體干重、三萜含量及三萜產量均達到最高值，分別為2.20g/100mL、45.88mg/g和100.83mg/100mL。當發(fā)酵時間長于11d后，各項指標均呈現平緩下降趨勢，由于發(fā)酵時間過長，粗毛纖孔菌生長達到飽和狀態(tài)后期出現菌絲體自溶，三萜代謝逐漸降低，所以綜合考慮選擇發(fā)酵培養(yǎng)時間為11d較好。

圖8 發(fā)酵時間對粗毛纖孔菌菌絲體干重和三萜含量、產量的影響Fig.8 Effect of fermentation time on mycelium dry weight and triterpene content，production of inonotus hispidus

3 結論

本實驗通過對粗毛纖孔菌產三萜類物質的液體發(fā)酵條件進行初步篩選，確定其最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源為黃豆粉，最佳無機鹽為磷酸二氫鉀和硫酸鎂，最佳維生素為VB1。其中以低廉的黃豆粉作為氮源，不僅顯著提高了菌絲體干重和三萜產量，而且節(jié)約了實驗成本。

通過正交實驗優(yōu)化粗毛纖孔菌菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為葡萄糖40g/L，黃豆粉5g/L，硫酸鎂1.5g/L，磷酸二氫鉀3g/L和維生素B10.05g/L。后期通過對其搖瓶發(fā)酵條件進行優(yōu)化，確定在接種量為3片，pH為6，裝液量為100mL/250mL三角瓶，轉速為155r/min，27℃條件下培養(yǎng)11d，發(fā)酵菌絲生物量可達2.20g/100mL，胞內三萜含量為45.88mg/g，胞內總三萜產量可達100.83mg/100mL。由于國內對粗毛纖孔菌研究較少，可通過與其他藥用真菌比較發(fā)現，粗毛纖孔菌三萜產量較高，如劉華研究樟芝液體發(fā)酵三萜產量為15.25mg/100mL[12]，靈芝發(fā)酵菌絲體為0.1～2mg/g[13]，赤芝單位菌絲體三萜含量為11.3mg/g[14]，所以粗毛纖孔菌具有很高的藥用開發(fā)價值，本實驗結果為對其進一步開發(fā)利用奠定了很好的基礎。

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