麥熱姆妮薩·艾麥爾，烏斯?jié)M·依米提，阿迪拉·多力坤，多力坤·麥麥提優(yōu)素莆

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊830046）

乳酸菌具有維持腸道正常菌群平衡，抑制腐敗菌繁殖，防止有害物質(zhì)產(chǎn)生，延緩衰老，抗腫瘤，降血脂，降膽固醇，增強(qiáng)免疫力等保健功能[1-4]。乳酸菌能抑制食品中的腐敗菌和致病菌，抑菌物質(zhì)主要是其代謝產(chǎn)物，如酸、過(guò)氧化氫、細(xì)菌素、雙乙酰等[5]。細(xì)菌素（Bacteriocin）是細(xì)菌在代謝過(guò)程中通過(guò)核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的一種具有抑菌活性的代謝產(chǎn)物，通常是低分子量的多肽或者蛋白類(lèi)物質(zhì)[6-7]。乳酸菌在代謝過(guò)程中還會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸、過(guò)氧化氫、二氧化碳等物質(zhì)，這些物質(zhì)協(xié)同乳酸菌所產(chǎn)生的乳酸菌素來(lái)抑制食品中腐敗菌和致病菌的生長(zhǎng)，而乳酸菌素本身能夠被人體消化道分泌的酶降解，它作為一種生物防腐劑已經(jīng)越來(lái)越受到人們的重視[8]。隨著人民健康意識(shí)的提高，人們?cè)絹?lái)越傾向于預(yù)防疾病而非治療疾病，于是便對(duì)功能性保健食品產(chǎn)生了濃厚的興趣，尤其是可作為食品添加劑的乳酸菌制品。所以，本文將選題的方向定于對(duì)從人體腸道中分離的乳酸菌的抑菌作用的研究，利用濾紙片法，通過(guò)27株乳酸菌（其中18株分離于長(zhǎng)壽老人糞便中）發(fā)酵上清液對(duì)3株致病菌的抑菌實(shí)驗(yàn)（并對(duì)上清液調(diào)節(jié)不同pH、經(jīng)熱和胃蛋白酶、胰蛋白酶處理）。初步分析乳酸菌抑菌活性物質(zhì)的特性及抑菌能力范圍，從而篩選出其中對(duì)人體腸道致病菌抑菌活性較強(qiáng)的菌株，以便作為發(fā)酵劑用于生產(chǎn)，為人們提供安全、方便的生活用品。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)菌株 在本實(shí)驗(yàn)室從和田維吾爾族長(zhǎng)壽老人和一般健康人腸道中分離鑒定的27株菌株（屬于植物乳桿菌屬、腸球菌屬）；致病菌 本實(shí)驗(yàn)室保藏的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等三種常見(jiàn)致病菌；MRS液體培養(yǎng)基 用于乳酸菌的發(fā)酵培養(yǎng)[9]；細(xì)菌肉湯培養(yǎng)基（LB） 用于致病菌的培養(yǎng)和抑菌能力的測(cè)定；胃蛋白酶、胰蛋白酶、色譜純?nèi)樗帷⒁宜?、丙酸、丁酸?.1%磷酸緩沖液、氫氧化鈉、鹽酸。

高壓滅菌鍋 上海博迅公司；GXZ型智能光照培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠(chǎng)；JD200-3型電子天平 沈陽(yáng)龍騰電子稱(chēng)量?jī)x器有限公司；SWCJ-1F型超凈工作臺(tái) 江蘇蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司；哈納酸度離子計(jì)pH211 北京哈納科儀科技有限公司；新飛電冰箱 河南新飛冰箱有限公司；冷凍離心機(jī) Thermo LEGEND MICRO 17R；微量移液槍 Eppendorf；恒溫水浴鍋 北京長(zhǎng)風(fēng)儀器廠(chǎng)；濾紙片 上海得潔過(guò)濾材料有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化 將乳酸菌接種于MRS培養(yǎng)基中37℃復(fù)活24h后傳3代，再接種于MRS液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)24h，備用。致病菌接種于細(xì)菌肉湯培養(yǎng)基中37℃復(fù)活24h，傳代2～3次后接種于液體細(xì)菌肉湯培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24h，備用。

1.2.2 細(xì)菌發(fā)酵及預(yù)處理 100mL MRS肉湯培養(yǎng)基，按2%接種量接入菌種，37℃培養(yǎng)48h。發(fā)酵產(chǎn)物8000r/min離心10min，棄菌泥留上清液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)處理濃縮到10mL，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用此10倍發(fā)酵濃縮液。

1.2.3 抑菌活性測(cè)定 采用濾紙片法測(cè)定樣品的抑菌活性，具體操作為：吸取100μL致病菌菌懸液，無(wú)菌涂布棒涂布于最適培養(yǎng)基平板，涂布均勻，合上皿蓋，在20℃恒溫培養(yǎng)箱中固定30min，取出培養(yǎng)皿，放5～6個(gè)已經(jīng)浸泡在發(fā)酵液中的濾紙片，迅速轉(zhuǎn)入恒溫培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)48h，觀(guān)察平板上的抑菌圈大小并拍照。

1.2.4 pH對(duì)樣品抑菌活性的影響 用濃鹽酸和濃氫氧化鈉調(diào)節(jié)待測(cè)樣品的pH分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0；以濃鹽酸調(diào)節(jié)0.1%磷酸緩沖液至pH分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0作為對(duì)照樣品，以三種致病菌作為指示菌測(cè)定抑菌圈大小[11-12]。

1.2.5 熱處理對(duì)樣品抑菌活性的影響 樣品在50、80、100℃水浴中分別處理20min，以三種致病菌作為指示菌測(cè)定抑菌圈的大小[13-14]。

1.2.6 蛋白酶處理對(duì)樣品抑菌活性的影響 用胃蛋白酶、胰蛋白酶分別在最適條件下分別以0、100、200μL/mL處理樣品。同時(shí)以生理鹽水和不加酶（0作用）的樣品作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照，并保持樣品濃度一致。處理后以鹽酸和氫氧化鈉將樣品的pH調(diào)回至原始pH附近（pH=4），測(cè)定抑菌活性[15]。

表1 兩種蛋白酶處理?xiàng)l件Table 1 The treatment condition of 2 kinds of proteinases

1.2.7 發(fā)酵過(guò)程中抑菌活性的變化 按1%接種量將待測(cè)樣品接種于12瓶MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，每4h取出一瓶，測(cè)定pH和生長(zhǎng)曲線(xiàn)并經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮成10倍濃縮液，測(cè)定抑菌圈大小。

1.2.8 樣品有機(jī)酸的分析 采用高效液相色譜法測(cè)定[16-17]，此項(xiàng)測(cè)定交由中國(guó)科學(xué)院新疆分院理化所完成。

1.2.9 有機(jī)酸抑菌活性的測(cè)定 根據(jù)液相色譜的結(jié)果用不同的濃度的乳酸、乙酸、丙酸、丁酸及共同組合進(jìn)行三種指示菌抑菌活性的測(cè)定，并預(yù)先用鹽酸或氫氧化鈉將有機(jī)酸樣品pH調(diào)至4[18]。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸菌對(duì)致病菌的抑菌作用

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，所有實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)金黃色葡萄球菌均具有抑菌作用，除了菌株R02-25、R03-114、R04-31、S06、R05-34、R08-22對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌沒(méi)有抑菌作用外，其他菌株都有抑菌作用。所有實(shí)驗(yàn)菌株所產(chǎn)生的抑菌圈大小不一，介于8～24mm之間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明，來(lái)自長(zhǎng)壽老人腸道中分離的菌株對(duì)三種指示菌的抑菌能力高于來(lái)自一般人腸道中分離的菌株，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用而言，抑菌圈高于12mm的菌株是14株，其中分離于長(zhǎng)壽老人腸道的菌株是11株。

表2 27株實(shí)驗(yàn)菌株抑菌結(jié)果（mm）Table 2 The antibacterial experiment results of 27 strains bacteria（mm）

一般研究認(rèn)為，乳酸菌可以產(chǎn)生細(xì)菌素主要對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌產(chǎn)生抑制或殺死作用[19]。本實(shí)驗(yàn)中R01-23、R02-23、R03-13、S04、S08五株不同種的腸球菌具有廣譜抗菌作用，不僅對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具有抑制作用，還對(duì)大腸桿菌等革蘭氏陰性菌也有抑制作用。所有樣品10倍發(fā)酵濃縮液的pH和抑菌效果見(jiàn)表2。

由于實(shí)驗(yàn)菌株R02-23、R03-13、S04對(duì)三種指示菌抑制效果均較好，作為進(jìn)一步研究的樣品。從抑菌結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，同一樣品對(duì)不同指示菌的抑制作用是特異性的。如R02-23對(duì)枯草芽孢桿菌的平均抑菌圈直徑可達(dá)21mm，而對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌卻抑制稍微弱，抑菌圈分別為17、18mm；R03-13對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌分別為23、19、18mm；而S04對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌分別為24、16、19mm。產(chǎn)生差異的可能原因是不同細(xì)菌發(fā)酵液的成分不同，可能含有一種以上抑菌物質(zhì)，指示菌對(duì)不同抑菌物質(zhì)的敏感程度不同導(dǎo)致抑菌活性的差異性。

2.2 pH對(duì)樣品抑菌活性的影響

實(shí)驗(yàn)菌株R02-23、R03-13、S04的發(fā)酵濃縮液經(jīng)pH調(diào)節(jié)后檢測(cè)對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌活性。表3和圖1顯示調(diào)pH后實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)致病菌抑菌活性的變化。

三個(gè)樣品在pH低于5.0時(shí)均顯示出抑菌活性，且隨pH降低，抑菌圈直徑增大；當(dāng)pH為5.0時(shí)，只有菌株R03-13對(duì)金黃色葡萄球菌有抑菌活性；pH高于6.0后無(wú)抑菌活性。磷酸-鹽酸緩沖液（對(duì)照）當(dāng)pH達(dá)到2.0時(shí)才出現(xiàn)弱的抑菌作用，說(shuō)明低pH是產(chǎn)生抑菌效果的一個(gè)必要條件，在低pH下，抑菌物質(zhì)的抑菌作用增強(qiáng)。但pH只是一個(gè)條件因子，在一定范圍內(nèi)，僅有低pH而沒(méi)有抑菌物質(zhì)的存在并不能產(chǎn)生理想的抑菌效果。

2.3 溫度對(duì)抑菌活性的影響

以三種致病菌作為指示菌，表4顯示了3種溫度條件處理對(duì)R02-23、R03-13和S04發(fā)酵濃縮液抑菌大小的影響。大分子蛋白質(zhì)在80℃高溫下應(yīng)變性失活，而三種發(fā)酵濃縮液經(jīng)80℃預(yù)處理30min后每株實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)三種致病菌的抑菌圈14～22mm之間，經(jīng)100℃預(yù)處理30min后抑菌圈直徑稍微下降，但不是很明顯，說(shuō)明抑菌物質(zhì)對(duì)熱不敏感，排除了大分子蛋白質(zhì)作為抑菌物質(zhì)的可能。

2.4 蛋白酶處理對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株抑菌活性的影響

以三種致病菌作為指示菌，表5顯示了蛋白酶處理后R02-23、R03-13和S04抑菌活性的變化。經(jīng)胰蛋白酶處理后抑菌效果有較明顯下降，且酶作用量越大，下降的越多；經(jīng)胃蛋白酶處理后抑菌活性沒(méi)有明顯下降。其原因是胰蛋白酶的pH等于8，直接影響抑菌效果。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[19]，小分子熱穩(wěn)定肽是一大類(lèi)細(xì)菌素，抑菌譜的大小因細(xì)菌素種類(lèi)的不同差異很大。本研究中抑菌物質(zhì)對(duì)某些蛋白酶敏感，加上已經(jīng)排除了對(duì)熱敏感的大分子蛋白質(zhì)，說(shuō)明抑菌物質(zhì)可能是小分子多肽類(lèi)細(xì)菌素。

表3 樣品pH調(diào)節(jié)對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株抑菌活性的影響（mm）Table 3 The effect of pH adjustment on antibacterial activity of exprement strains（mm）

表4 熱處理后樣品抑菌圈的變化（mm）Table 4The change of the antibacterial cycles through heat treatment（mm）

表5 蛋白酶處理對(duì)樣品株抑菌活性的影響（抑菌圈直徑為mm）Table 5 The effect of proteinases treatment on antibacterial activity（mm）

2.5 發(fā)酵過(guò)程中抑菌活性的變化

以三種致病菌作為指示菌，R02-23、R03-13和S04發(fā)酵過(guò)程中抑菌活性及生長(zhǎng)的變化見(jiàn)圖1。S04在24h以后對(duì)三種致病菌的抑菌效果達(dá)到最大且保持穩(wěn)定，而R02-23和R03-13在生長(zhǎng)到28h以后對(duì)三種致病菌的抑菌效果才表現(xiàn)最大，三個(gè)樣品的抑菌效果與細(xì)菌的生長(zhǎng)緊密相關(guān)，隨著細(xì)菌生長(zhǎng)量的增加，抑菌活性隨之增強(qiáng)。

圖1 三株菌的發(fā)酵生長(zhǎng)曲線(xiàn)，抑菌活性的變化Fig.1 The growth curve and the change of antibacterial activity

2.6 細(xì)菌發(fā)酵濃縮液樣品中有機(jī)酸含量的分析

利用高效液相色譜法測(cè)定10倍發(fā)酵液中的短鏈有機(jī)酸的含量。S04、R03-13、R02-23三株菌發(fā)酵液中主要的有機(jī)酸產(chǎn)物是乳酸分別為：13.55%、14.75%、15.04%，還有丁酸和乙酸，但是乙酸含量較少，乙酸含量分別為1.12%、1.21%、1.22%，并沒(méi)有丙酸。

2.7 有機(jī)酸抑菌活性的測(cè)定

根據(jù)表6中菌株10倍發(fā)酵濃縮液的有機(jī)酸含量配制了12種濃度的有機(jī)酸或有機(jī)酸混合物，pH被調(diào)節(jié)至發(fā)酵濃縮液的近似水平4.0。乙酸濃度取1%，乳酸濃度取10%、13%、15%和20%，丁酸濃度取4%。pH為4.0的鹽酸溶液作為對(duì)照也測(cè)定了抑菌圈大小。表7顯示了以不同濃度的乙酸、丁酸和乳酸組合作用于3種指示菌的抑菌效果。

表6 發(fā)酵液中有機(jī)酸的含量（%）Table 6 Deternmination results of some organic acids in fermentation liquid（%）

表7 有機(jī)酸對(duì)指示菌的抑制作用Table 7 The antibacterial activities of organic acids

有機(jī)酸抑菌效果的測(cè)定證實(shí)，乳酸和丁酸均有抑菌作用，并且隨著濃度升高而增大。對(duì)比細(xì)菌發(fā)酵液中有機(jī)酸的濃度可以發(fā)現(xiàn)，最高至4.84%的丁酸含量和最高至15.04%的乳酸含量足以產(chǎn)生抑菌作用，最高至1.22%的乙酸含量單獨(dú)情況下幾乎不足以產(chǎn)生抑菌作用，但丁酸和乳酸、丁酸和丙酸、丙酸和乳酸、丁酸和乳酸的混合酸在中等濃度就可以表現(xiàn)出全面的抑菌作用。

低pH能增強(qiáng)抑菌物質(zhì)的抑菌活性，如果樣品的pH高于4.5，即使乙酸、丁酸或乳酸的含量較高也沒(méi)有明顯的抑菌效果。

3 結(jié)論

18株實(shí)驗(yàn)菌株是來(lái)自維吾爾族集中居住的新疆和田地區(qū)長(zhǎng)壽老人腸道中，9株實(shí)驗(yàn)菌株是來(lái)自一般健康人腸道中。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，所有實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)金黃色葡萄球菌具有抑菌作用，除了菌株R02-25、R03-114、R04-31、S06、R05-34、R08-22對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌沒(méi)有抑菌作用外，其他菌株都有抑菌作用。R02-23、R03-13和S04三株菌具有最高的光裝液量為100mL/250mL三角瓶，轉(zhuǎn)速為155r/min，27℃條件下培養(yǎng)11d，發(fā)酵菌絲生物量可達(dá)2.20g/100mL，胞內(nèi)三萜含量為45.88mg/g，胞內(nèi)總?cè)飘a(chǎn)量可達(dá)100.83mg/100mL。由于國(guó)內(nèi)對(duì)粗毛纖孔菌研究較少，可通過(guò)與其他藥用真菌比較發(fā)現(xiàn)，粗毛纖孔菌三萜產(chǎn)量較高，如劉華研究樟芝液體發(fā)酵三萜產(chǎn)量為15.25mg/100mL[12]，靈芝發(fā)酵菌絲體為0.1～2mg/g[13]，赤芝單位菌絲體三萜含量為11.3mg/g[14]，所以粗毛纖孔菌具有很高的藥用開(kāi)發(fā)價(jià)值，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為對(duì)其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定了很好的基礎(chǔ)。

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