馮永方，韋 偉，童靜靜，馮鳳琴，*，宋俊梅，*

（1.山東輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，山東濟南 250353；2.浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，浙江杭州310058）

棕櫚油是世界上廣泛應用的一種食用植物油，主要產(chǎn)自馬來西亞和印度尼西亞等地[1-2]。棕櫚油經(jīng)分提可得到熔點不同的棕櫚液油、棕櫚超級液油和棕櫚硬脂。不同棕櫚油中脂肪酸的含量與分布相差較大，其中棕櫚硬脂中棕櫚酸含量最高，可達到48%～74%[3]。但其中的棕櫚酸主要分布在Sn-1，3位上，Sn-2位主要分布的是油酸，與母乳脂肪的脂肪酸分布相反[4]。母乳是目前嬰兒最理想的食品，但由于一些特殊原因?qū)е聼o法進行母乳喂養(yǎng)時，嬰幼兒配方奶粉成為一種較為理想的選擇[5]。研究發(fā)現(xiàn)，母乳中含有3.0%～4.5%的脂肪，卻是嬰兒50%左右能量得來源，由于其特殊的脂肪酸組成和分布，對維生素及礦物質(zhì)的吸收起到了關鍵作用[6-7]。母乳脂肪中棕櫚酸含量在20%～25%左右，其中70%左右的棕櫚酸分布在甘油三酯的Sn-2位[8-9]。而市售的嬰幼兒配方奶粉中的油脂主要是通過植物油調(diào)配而成，雖然脂肪酸含量及組成可做到與母乳相近，但Sn-2位棕櫚酸含量卻與母乳相差較大[10]。在體內(nèi)脂肪酶的作用下，配方奶粉中甘油三酯分解為Sn-1，3位的游離脂肪酸和Sn-2位的單甘酯。熔點高于人體溫度的游離棕櫚酸在堿性環(huán)境的小腸內(nèi)與鈣、鎂等礦物質(zhì)容易形成不溶性的皂化物，直接排除體外，從而造成了鈣質(zhì)的大量流失以及使嬰幼兒糞便硬度增加，導致嬰幼兒便秘和腹痛，甚至引發(fā)腸梗阻[11-12]。因此，對動植物油脂的結(jié)構(gòu)進行改造和優(yōu)化，制備可替代母乳脂肪的結(jié)構(gòu)油脂，是改善嬰幼兒營養(yǎng)和健康的必然趨勢。在我國，目前制備母乳脂肪替代油脂的主要原料為豬油，但因為風俗習慣以及宗教忌諱問題，除了日本個別品牌的嬰兒配方奶粉中使用了豬油外，其他國家和地區(qū)都沒有把豬油用在嬰幼兒配方奶粉中，因此以豬油生產(chǎn)的產(chǎn)品的市場潛力遠小于用植物油為原料生產(chǎn)的產(chǎn)品。植物油中當屬棕櫚油富含棕櫚酸，但棕櫚酸主要分布在Sn-1，3位，因此，對棕櫚油的Sn-2位棕櫚酸進行富集是制備母乳脂肪替代油脂的前提。本研究采用有機溶劑體系，以非專一性脂肪酶為催化劑，催化棕櫚酸與棕櫚硬脂進行酸解反應，以提高Sn-2位棕櫚酸含量，為下一步制備母乳脂肪替代油脂提供原料。采用響應面分析法（RSM），可以通過較少的實驗次數(shù)獲得較滿意的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

棕櫚硬脂 金光食品有限公司，其熔點為49℃[13]，脂肪酸組成見表1；Novozym 435非專一性脂肪酶 諾維信公司，酶活為10000PLU/g；豬胰脂酶 Sigma公司，酶活為12700U/g；2，7-二氯熒光素 西域科技（中國）；三羥甲基甲胺 上海傳信化工有限公司；GF254硅膠 青島海洋化工有限公司；膽酸鈉（生化試劑）、棕櫚酸、正己烷、無水乙醚、95%乙醇、氯化鈣、鹽酸、氫氧化鉀 國藥集團化學試劑有限公司，分析純；甲醇、正己烷 天津市四友精細化學品有限公司，色譜純；甲酸 宜興市第二化學試劑廠，分析純。

GC-6890型氣相色譜儀（配有氫火焰離子化檢測器）、DB-23型毛細管色譜柱 安捷倫科技有限公司；THZ-82型水浴恒溫振蕩器 中國金壇市精達儀器制造廠；BSA224S型電子分析天平 德國賽多利集團；SB-2型薄層色譜噴霧泵 中國天津市天分分析儀器廠。

表1 棕櫚硬脂中脂肪酸組成（%）Table 1 Composition of fatty acid in palm stearin（%）

1.2 實驗方法

酶法酯交換方法：在25mL的圓底燒瓶中加入一定質(zhì)量比的棕櫚酸和棕櫚硬脂，加一定量的正己烷，在一定溫度的水浴恒溫振蕩器中振蕩10min，使反應體系達到預定的反應溫度，然后加入一定量的非專一性脂肪酶，反應一定時間后，過濾除去脂肪酶以終止反應，除去游離脂肪酸后對產(chǎn)物中甘油三酯進行分析。

典型反應：在25mL的圓底燒瓶中加入0.25g棕櫚酸、0.25g棕櫚硬脂、一定量正己烷和50mg Novozym 435，溫度為55℃，以一定轉(zhuǎn)速搖床反應12h[15]。

1.2.1 色譜條件 色譜柱：DB-23石英毛細柱（60m×0.25mm×0.25μm）；汽化室溫度：250℃；檢測器FID溫度250℃；升溫程序：160℃以20℃/min升至180℃，保持6min，以20℃/min升至220℃，保持5min，以20℃/min升至230℃，保持10.5min；氫氣流量：40mL/min；空氣流量：400mL/min；載氣（N2）流速1.16mL/min，壓力27.947psi；進樣量1.0μL；分流比50∶1。

1.2.2 實驗設計 本實驗首先對轉(zhuǎn)速、溶劑量、底物質(zhì)量比、反應時間、反應溫度、加酶量和水分含量進行單因素實驗，然后在單因素實驗的基礎上進行最陡爬坡實驗并確定了Box-Behnken中心組合實驗設計的中心點及步長，最后進行了四因素三水平的29組響應面實驗，響應面實驗因素水平表如表2所示。

表2 響應面分析因素與水平表Table 2 Factors and levels of response surface analysis

1.2.3 產(chǎn)物純化 將反應后的混合物溶解在一定量的正己烷中，加一定體積的0.5moL/L的氫氧化鉀水醇（水∶乙醇=7∶3，v∶v）溶液在70℃的條件下除酸，將上層有機相移入2mL離心管中以待下一步分析[16]。

將純化后的產(chǎn)物進行薄層層析（TLC），對最終產(chǎn)物中成分進行分析。

1.2.4 測定方法 總脂肪酸的測定：將油脂溶解在正己烷中，加入氫氧化鉀甲醇溶液通過酯交換甲酯化，反應完全后，用硫酸氫鈉中和剩余的氫氧化鉀，以避免甲酯皂化[17]，待鹽沉淀后，將上層有機相進樣，經(jīng)過氫火焰離子化檢測器（GC-FID）進行檢測，測得油脂中總脂肪酸組分含量[18]。

Sn-2位脂肪酸的測定：將試樣中游離脂肪酸中和后，取一定量的油脂（如果油脂的熔點高于45℃，需將其溶解在正己烷中），用豬胰脂酶將甘油三酯水解成2-單甘酯，經(jīng)過薄層層析（TLC）分離[19-20]，刮下單甘酯條帶，將單甘酯溶解在正己烷中，用總脂肪酸測定同樣的方法和步驟測得油脂中Sn-2位脂肪酸組分含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有實驗采用3次重復取平均值，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差（±s）表示。采用SPSS（version 17.0）軟件中One-Way ANOVA進行顯著性分析，在p＜0.05水平上差異顯著性，用不同字母表示；在p＞0.05水平上差異無顯著性，用相同字母表示。使用Origin Pro 8.0軟件進行制圖，采用Design Expert 7進行響應面實驗設計及分析。

2 結(jié)果與討論

通過薄層層析（TLC）分析發(fā)現(xiàn)棕櫚硬脂除甘油三酯外，存在少量的甘油二酯，且無單甘酯的存在，如圖1（左）所示。將酶法酯交換反應后的產(chǎn)物經(jīng)過0.5moL/L的氫氧化鉀水醇（水∶乙醇=7∶3，v∶v）溶液在70℃的條件下除酸后，經(jīng)薄層層析（TLC）分析發(fā)現(xiàn)反應產(chǎn)物中只有甘油三酯，如圖1（右）所示。因此，純化后的最終產(chǎn)物中無單甘酯和甘油二酯的存在，這是因為在反應過程中，棕櫚酸與非甘油三酯成分在非專一性脂肪酶的作用下發(fā)生了反應，將其轉(zhuǎn)化為甘油三酯。所以，在以下實驗分析中，所述的Sn-2位棕櫚酸含量即為甘油三酯中的含量。

圖1 棕櫚硬脂（左）與最終產(chǎn)物（右）的TLC圖譜比較Fig.1 Comparison of TLC map between palm stearin（left） and final product（right）

2.1 酶法酯交換單因素條件優(yōu)選

2.1.1 轉(zhuǎn)速對棕櫚酸含量與分布的影響 在25mL的圓底燒瓶中加入0.25g棕櫚酸、0.25g棕櫚硬脂、5mL/g反應混合物的正己烷和50mg非專一性脂肪酶Novozym 435，在55℃條件下，分別以150、175、200、225r/min不同轉(zhuǎn)速搖床反應12h。反應結(jié)束后，過濾除酶除酸，采用氣相色譜法分別測定每個樣品中總棕櫚酸和Sn-2位棕櫚酸含量，結(jié)果見圖2。

圖2 轉(zhuǎn)速對產(chǎn)物中棕櫚酸分布的影響Fig.2 Impact of speed on the distribution of the palm acid in the products

由圖2可見，轉(zhuǎn)速對總棕櫚酸含量的影響較小，大于200r/min時總棕櫚酸含量有所降低。但不同轉(zhuǎn)速對Sn-2位棕櫚酸含量的影響較大，當轉(zhuǎn)速為200r/min時，產(chǎn)物中Sn-2位棕櫚酸到達最大值為58.96%。因此，選擇轉(zhuǎn)速200r/min較適合。

2.1.2 溶劑量對棕櫚酸含量與分布的影響 在25mL的圓底燒瓶中加入0.25g棕櫚酸、0.25g棕櫚硬脂和50mg非專一性脂肪酶Novozym 435，在55℃條件下，分別加4、6、8、10、12、14mL/g反應混合物的正己烷，在200r/min的轉(zhuǎn)速下?lián)u床反應12h。反應結(jié)束后，過濾除酶，采用氣相色譜法分別測定每個樣品中總棕櫚酸和Sn-2位棕櫚酸含量，結(jié)果見圖3。

圖3 溶劑量對產(chǎn)物中棕櫚酸分布的影響Fig.3 Impact of solvent quantity on the distribution of the palm acid in the products

由圖3可見，溶劑量對總棕櫚酸和Sn-2位棕櫚酸含量都有一定程度的影響，都有先升后降的趨勢。溶劑量較小時，可能由于熔點為63℃的棕櫚酸溶解性差使得反應速率慢；但當溶劑量較大時，由于酶與底物的接觸機會降低，從而影響了反應速率。當溶劑量為8mL/g反應混合物時，產(chǎn)物中總棕櫚酸和Sn-2位棕櫚酸含量同時達到最高值，分別為69.76%和62.41%。因此，選擇溶劑量為8mL/g反應混合物最為適合。

2.1.3 底物質(zhì)量比對棕櫚酸含量與分布的影響 在25mL的圓底燒瓶中加入0.25g棕櫚硬脂、50mg非專一性脂肪酶Novozym 435，棕櫚酸與棕櫚硬脂按0.25∶1、0.5∶1、0.75∶1、1∶1、1.25∶1和1.5∶1（均為質(zhì)量比）加入，分別加入8mL/g反應混合物的正己烷，在55℃條件下，以200r/min的轉(zhuǎn)速搖床反應12h。反應結(jié)束后，過濾除酶除酸，采用氣相色譜法分別測定每個樣品的總棕櫚酸和Sn-2位棕櫚酸含量，結(jié)果見圖4。

圖4 底物質(zhì)量比對產(chǎn)物中棕櫚酸分布的影響Fig.4 Impact of substrate quality ratio on the distribution of the palm acid in the products

由圖4可見，隨著棕櫚酸含量的增加，產(chǎn)物中總棕櫚酸含量一直呈上升趨勢；但Sn-2位棕櫚酸先緩慢上升，在底物質(zhì)量比為1∶1時出現(xiàn)最高值，當棕櫚酸含量繼續(xù)上升時，Sn-2位棕櫚酸反而下降，且下降趨勢明顯。這可能是因為大量棕櫚酸的存在影響了脂肪酶對Sn-2位的作用。因此，選擇底物質(zhì)量比1∶1最為適合。

2.1.4 反應時間對棕櫚酸含量與分布的影響 在25mL的圓底燒瓶中加入0.25g棕櫚酸、0.25g棕櫚硬脂、50mg非專一性脂肪酶Novozym 435和8mL/g反應混合物的正己烷，在55℃條件下，以200r/min的轉(zhuǎn)速分別搖床反應6、12、18、24、30、36、42、48h。反應結(jié)束后，過濾除酶除酸，采用氣相色譜法分別測定每個樣品的總棕櫚酸和Sn-2位棕櫚酸含量，結(jié)果見圖5。

圖5 反應時間對產(chǎn)物中棕櫚酸分布的影響Fig.5 Impact of reaction time on the distribution of the palm acid in the products

由圖5可見，隨著反應時間的延長，總棕櫚酸含量前24h呈現(xiàn)上升趨勢，隨后呈現(xiàn)波動狀態(tài)；而Sn-2位棕櫚酸前24h上升幅度較大，24h后上升比前階段緩慢，在42h有下降現(xiàn)象出現(xiàn)。這可能是因為反應到達一定時間后，反應體系中脂肪酸到達平衡。在反應時間為36h時，總棕櫚酸和Sn-2位棕櫚酸含量分別達到最大值為77.38%和77.50%。

2.1.5 反應溫度對棕櫚酸含量與分布的影響 在25mL的圓底燒瓶中加入0.25g棕櫚酸、0.25g棕櫚硬脂、50mg非專一性脂肪酶Novozym 435、8mL/g反應混合物的正己烷，分別在45、50、55、60、65℃條件下，以200r/min的轉(zhuǎn)速分別搖床反應12h。反應結(jié)束后，過濾除酶除酸，采用氣相色譜法分別測定每個樣品的總棕櫚酸和Sn-2位棕櫚酸含量，結(jié)果見圖6。

圖6 反應溫度對產(chǎn)物中棕櫚酸分布的影響Fig.6 Impact of reaction temperature on the distribution of the palm acid in the products

由圖6可見，隨著溫度的升高，總棕櫚酸和Sn-2位棕櫚酸含量都呈現(xiàn)上升趨勢，Sn-2位棕櫚酸上升幅度大于總棕櫚酸的上升幅度。在不考慮脂肪酶使用次數(shù)的前提下，溫度越高越好；但當溫度達到一定高度時會影響酶活，考慮到酶的使用次數(shù)和生產(chǎn)周期的問題，選擇50～60℃較為合適。

2.1.6 加酶量對棕櫚酸含量與分布的影響 在25mL的圓底燒瓶中加入0.25g棕櫚酸、0.25g棕櫚硬脂和8mL/g反應混合物的正己烷，分別加入10%、15%、20%、25%、30%和35%（以棕櫚硬脂質(zhì)量計）的非專一性脂肪酶Novozym 435，在55℃條件下，以200r/min的轉(zhuǎn)速搖床反應12h。反應結(jié)束后，過濾除酶，采用氣相色譜法分別測定每個樣品的總棕櫚酸和Sn-2位棕櫚酸含量，結(jié)果見圖7。

圖7 加酶量對產(chǎn)物中棕櫚酸分布的影響Fig.7 Impact of enzyme load on the distribution of the palm acid in the products

由圖7可見，隨著加酶量的增加，總棕櫚酸含量先升高后下降，但Sn-2位棕櫚酸含量一直處于上升趨勢?？紤]到非專一性脂肪酶成本高的問題，所以選擇上升幅度最大的15%～25%作為研究區(qū)域。

2.1.7 水分含量對棕櫚酸含量與分布的影響 在25mL的圓底燒瓶中加入0.25g棕櫚酸、0.25g棕櫚硬脂、50mg非專一性脂肪酶Novozym 435、8mL/g反應混合物的正己烷，分別加入0%、3%、6%、9%、12%、15%和18%（以非專一性脂肪酶質(zhì)量計）去離子水，在55℃條件下，以200r/min的轉(zhuǎn)速搖床反應12h。反應結(jié)束后，過濾除酶除酸，采用氣相色譜法分別測定每個樣品的總棕櫚酸和Sn-2位棕櫚酸含量，結(jié)果見圖8。

圖8 水分含量對產(chǎn)物中棕櫚酸分布的影響Fig.8 Impact of moisture content on the distribution of the palm acid in the products

由圖8可見，隨著水分含量的增加，總棕櫚酸和Sn-2位棕櫚酸含量在3%下有稍微的升高后一直呈現(xiàn)下降趨勢，其中Sn-2位棕櫚酸含量下降趨勢非常明顯。與不加水相比，Sn-2位棕櫚酸含量上升程度很小，考慮到操作復雜問題，所以在響應面優(yōu)化實驗中選擇不加水。

2.2 酶法酯交換響應面實驗優(yōu)化

2.2.1 最陡爬坡實驗 響應面擬合方程僅在考察的臨近區(qū)域才可與真實情況近似，因此，應先逼近Sn-2位棕櫚酸含量達到60%區(qū)域后再建立有效的擬合方程。由單因素的實驗結(jié)果選取底物質(zhì)量比（A）、反應時間（B）、反應溫度（C）和加酶量（D）四個對Sn-2位棕櫚酸含量（Y）影響較大的因素進行最陡爬坡實驗。由于非專一性脂肪酶高昂的價格及在較高溫度下容易失活的特點，根據(jù)文獻報道[15]及廠家提供的信息，選擇加酶量20%（以棕櫚硬脂質(zhì)量計）和反應溫度55℃作為的中心點，在此溫度及加酶量下的生產(chǎn)成本較低。在單因素實驗的基礎上，設計它們的步長，具體見表3。由表3可以看出，在2階段組合實驗的響應值最接近60%，所以選擇2階段組合實驗作為響應面實驗的中心實驗點。

表3 最陡爬坡實驗設計及結(jié)果Table 3 Design and result of steepest ascent experiment

2.2.2 實驗設計及結(jié)果 在單因素實驗及最陡爬坡實驗確定酯交換反應的適宜底物質(zhì)量比、反應時間、反應溫度和加酶量的基礎上，根據(jù)Box-Behnken中心組合設計原理，以底物質(zhì)量比（A）、反應時間（B）、反應溫度（C）和加酶量（D）為自變量，以產(chǎn)物中Sn-2位棕櫚酸含量為響應值（Y），設計四因素三水平共29個實驗點的響應面分析實驗，建立二次多項式回歸模型，根據(jù)Box-Behnken實驗設計的統(tǒng)計學要求，對29組實驗進行回歸擬合，實驗設計及結(jié)果見表4。

表4 Box-Behnken實驗設計及結(jié)果Table 4 Design and result of Box-Behnken experiment

2.2.3 回歸模型建立及方差分析 利用Design Expert軟件，通過多項式回歸分析和逆向消除分析方法對表4實驗結(jié)果進行回歸擬合，獲得Sn-2位棕櫚酸含量（Y）對自變量底物質(zhì)量比（A）、反應時間（B）、反應溫度（C）和加酶量（D）的二次多項回歸方程：

由表5方差分析結(jié)果可以看出，本實驗所選用的二次多項模型極顯著（p＜0.0001），其中，B、C、D對實驗結(jié)果具有極顯著的影響，C2達到高度顯著水平，A、B2達到顯著水平；方程的失擬項不顯著（p=0.2074），說明各因素值和響應值之間的關系可以用此模型來函數(shù)化。相關系數(shù)R2Adj=0.9367，表明Sn-2位棕櫚酸含量的實測值與預測值之間具有較好的擬合度。其校正決定系數(shù)R2=0.9683，表明僅有約3.2%的Sn-2位棕櫚酸含量的總變異不能由此模型進行解釋。

表5 方差分析表Table 5 Variance of analysis

從四個因素對Sn-2位棕櫚酸含量的影響來看，回歸方程的一次項A、B、C、D對Sn-2位棕櫚酸含量的線性效應顯著，且影響順序A＜B=C=D；二次項B2和C2對Sn-2位棕櫚酸的曲面效應顯著，而其他二次項和兩兩因素間的交互作用不顯著。

當Sn-2位棕櫚酸含量達到60%時，即可作為下一步制備母乳化結(jié)構(gòu)油脂的原料。通過響應面優(yōu)化得到Sn-2位棕櫚酸含量達到60%時的最佳工藝條件為：棕櫚酸與棕櫚硬脂質(zhì)量比1.09∶1，反應時間9.9h，反應溫度54.7℃，加酶量21.9%。采用上述優(yōu)化后的條件對實驗結(jié)果進行驗證，三次平行實驗，測得產(chǎn)物中Sn-2位棕櫚酸含量平均值為60.59%，與理論預測值基本吻合。

3 結(jié)論

棕櫚酸與棕櫚硬脂在非專一性脂肪酶Novozym 435的催化下進行酸解反應，棕櫚硬脂中Sn-2位棕櫚酸得到大幅度提高，得到的甘油三酯完全可以滿足下一步制備母乳化結(jié)構(gòu)油脂的要求。通過單因素實驗，得到最佳轉(zhuǎn)速為200r/min，溶劑量為8mL/g反應混合物。四因素三水平的響應面分析得到的產(chǎn)物Sn-2位棕櫚酸含量為44%～78%。下一步制備母乳脂肪替代油脂時，根據(jù)產(chǎn)物的指標要求不同，可選取不同的條件制備得到Sn-2位棕櫚酸含量不同的甘油三酯。在最優(yōu)工藝條件為：棕櫚酸與棕櫚硬脂質(zhì)量比1.09∶1，反應時間9.9h，反應溫度54.7℃，加酶量21.9%時，甘油三酯中Sn-2位棕櫚酸含量可達到60.59%。

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