沈 蓓 吳啟南 伍城穎 王新勝 賀瀟瀟 陳廣云 (南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210046)

芡實(shí)提取物對衰老小鼠腦組織p53蛋白表達(dá)的影響及機(jī)制

沈 蓓 吳啟南 伍城穎 王新勝 賀瀟瀟 陳廣云 (南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210046)

目的 觀察芡實(shí)提取物對D-半乳糖(D-gal)致衰老小鼠氧化系統(tǒng)指標(biāo)及p53蛋白表達(dá)的影響，探討芡實(shí)提取物延緩衰老的機(jī)制。方法 104只昆明雄性小鼠隨機(jī)分為正常對照組，D-gal模型組，芡實(shí)乙醇提取物高、低劑量組，芡實(shí)乙酸乙酯提取物高、低劑量組，芡實(shí)正丁醇提取物高、低劑量組。各組用相應(yīng)藥物連續(xù)處理6 w。用比色法檢測小鼠腦組織總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性。用HE染色法和免疫組織化學(xué)染色法檢測小鼠腦組織海馬區(qū)細(xì)胞形態(tài)和p53蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 芡實(shí)提取物能有效提高衰老小鼠腦組織T-AOC、SOD和GSH-Px水平(P＜0.05，P＜0.01)，降低MDA含量(P＜0.05，P＜0.01)，且呈量效依賴關(guān)系，還能改善海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞受損狀態(tài)，下調(diào)p53蛋白的表達(dá)(P＜0.05)。結(jié)論 芡實(shí)提取物可下調(diào)p53蛋白的表達(dá)，其機(jī)制可能與清除自由基及改善腦組織海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞受損情況有關(guān)。

芡實(shí)提取物;抗氧化;p53蛋白

p53屬于腫瘤壞死基因/神經(jīng)生長因子受體家族，其表達(dá)產(chǎn)物具有傳遞凋亡信號的作用，因此本實(shí)驗(yàn)選擇該基因作為主要參考指標(biāo)來研究芡實(shí)延緩衰老的作用。芡實(shí)為睡蓮科水生植物芡的干燥成熟種仁，具有益腎固精、補(bǔ)脾止瀉、延緩衰老的功效，已有較多研究報(bào)道，芡實(shí)水和乙醇提取物具有抗氧化〔1〕、抗心肌缺血〔2〕及輔助治療腦卒中后遺癥〔3〕等作用，這說明芡實(shí)在心腦血管疾病治療方面有著潛在的可研究價(jià)值，但迄今為止，尚未見芡實(shí)及其提取物在這方面的報(bào)道。為此，本文以腹腔注射D-半乳糖的方法建立小鼠腦衰老模型進(jìn)行上述研究，以評價(jià)芡實(shí)幾種提取物在延緩腦衰老方面的作用及其影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 芡實(shí)提取物的制備

乙醇提取物：稱取干燥芡實(shí)，用8倍量80%乙醇，回流提取2次，每次8 h，合并提取液，減壓濃縮為浸膏，即得。乙酸乙酯提取物：同法先制備上述乙醇提取物，減壓濃縮后得到的浸膏用水混懸，以少量多次原則，乙酸乙酯萃取6次，合并萃取液，回收乙酸乙酯層，減壓濃縮為浸膏，即得。正丁醇提取物：稱取干燥芡實(shí)，用8倍量水飽和正丁醇，回流提取2次，每次8 h，合并提取液，減壓濃縮為浸膏，即得。芡實(shí)購于北京中葛綠元科技有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室吳啟南教授鑒定為為睡蓮科植物芡Euryale ferox Salisb.的成熟種仁。

1.2 藥品與試劑

AOC)、虧氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);p53單克隆抗體和免疫組化SABC試劑盒(美國Zymed公司);DAB顯色劑(北京中山生物技術(shù)公司);多聚甲醛生化試劑(Sigma公司)。

1.3 動(dòng)物

清潔級昆明種小鼠104只，雄性，體質(zhì)量18～22 g，由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號：SCXK(蘇)2009-0002。

1.4 儀器

FSH-2A可調(diào)高速電動(dòng)勻漿機(jī)(金壇市金南儀器廠);LXJ-ⅡB低速大容量多管離心機(jī)(南京曉曉儀器設(shè)備有限公司);Powerwave X340全波長酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司);Yamato Kohki切片機(jī)(日本大和光機(jī)械工業(yè)株式會社);BX51TRF型顯微鏡(日本Olympus Optical公司);Eclipse E200型顯微鏡(日本Nikon公司);IPP顯微鏡圖像分析軟件(美國MEDIA CYBERNETICS公司)。

1.5 方法

1.5.1 建模與給藥 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后按體重隨機(jī)分為8組，每組13只，分別為正常對照組，模型組，芡實(shí)乙醇提取物高、低劑量組(500、250 mg·kg-1·d-1)、芡實(shí)乙酸乙酯提取物高、低劑量組(300、150 mg·kg-1·d-1)、芡實(shí)正丁醇提取物高、低劑量組(100、50 mg·kg-1·d-1)，以上三種提取物高、低劑量分別換算成生藥量是相一致的。模型組和給藥組每日上

D-半乳糖(Sigma公司);總抗氧化能力(T-午腹腔注射D-半乳糖500 mg·kg-1·d-1，正常對照組腹腔注射等量生理鹽水，下午給藥組分別灌胃相應(yīng)濃度的藥物，正常對照組和模型組分別灌胃等量生理鹽水，給藥量均為0.1 ml/10 g，連續(xù)42 d〔4〕，42 d后進(jìn)行生化指標(biāo)檢測和組織學(xué)考察。

1.5.2 免疫組織化學(xué)檢測 給藥結(jié)束后，斷頭，冰盤上迅速取小鼠大腦，4%多聚甲醛固定，石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2孵育，正常牛血清封閉，順序滴加一抗p53單克隆抗體(滴度1∶80)、羊抗鼠二抗、鏈霉親和素-生物素-酶復(fù)合物(SABC)液，DAB顯色劑。復(fù)染，脫水，透明，封片后顯微鏡觀察。分析單位視野下，陽性區(qū)域所占的百分?jǐn)?shù)。

1.5.3 生化指標(biāo)檢測 給藥結(jié)束后，斷頭，冰盤上迅速取小鼠大腦，預(yù)冷生理鹽水沖洗表面血液，濾紙吸干。用勻漿機(jī)加預(yù)冷生理鹽水研磨制成10%的腦組織勻漿，3 500 r/min低溫離心10 min，取上清。按各試劑盒說明檢測小鼠腦組織中T-AOC、SOD、MDA、GSH-Px及蛋白質(zhì)含量。取小鼠大腦置10%甲醛溶液中固定，制備病理組織切片，HE染色，對大腦皮層海馬進(jìn)行組織學(xué)觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

正常對照組和芡實(shí)提取物組小鼠毛發(fā)光亮而濃密、皮膚富有彈性。與正常對照組小鼠相比，模型組小鼠6 w后出現(xiàn)衰老跡象：毛發(fā)稀疏、行動(dòng)遲緩、飲食量減少、皮膚松弛、彈性下降等。

2.2 免疫組化染色結(jié)果

p53蛋白陽性表達(dá)為細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)或核膜上出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒。與正常對照組相比，模型組p53蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.05)。與模型組相比，芡實(shí)乙醇提取物高劑量組和芡實(shí)正丁醇提取物高、低劑量組p53蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，其余各組p53蛋白表達(dá)雖有所降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見表1)。

2.3 對衰老模型小鼠腦T-AOC、SOD、MDA、GSH-Px的影響

與正常對照組相比，模型組小鼠腦組織T-AOC、SOD、GSH-Px含量明顯降低(P＜0.01)，MDA含量明顯升高(P＜0.01)。各給藥組均能有效提高衰老小鼠腦組織T-AOC、SOD和GSH-Px含量(P＜0.05，P＜0.01)，同時(shí)顯著降低 MDA 含量(P＜0.01)，效果相當(dāng)，正丁醇提取物略顯優(yōu)勢(見表1)。

表1 對衰老模型小鼠腦組織T-AOC、SOD、MDA、GSH-Px、p53蛋白表達(dá)陽性面積比例的影響(s，n=13)

表1 對衰老模型小鼠腦組織T-AOC、SOD、MDA、GSH-Px、p53蛋白表達(dá)陽性面積比例的影響(s，n=13)

與正常對照組比較：1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;與模型組比較：3)P ＜0.05，4)P ＜0.01

組別 劑量(mg/kg)T-AOC(U/mgprot)SOD(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)GSH-Px(U/mgprot)p53陽性面積(%)正常對照組 - 2.16±0.47 50.31±3.414) 4.27±0.744) 39.31±3.604) 0.25±0.173)模型組 - 1.56±0.06 38.87±1.572) 6.30±0.582) 30.47±1.622) 3.58±0.911)乙醇提取物高劑量組 500 1.87±0.21 44.67±2.703) 3.69±0.424) 40.04±1.494) 0.28±0.193)乙醇提取物低劑量組 250 1.67±0.23 43.64±5.65 4.14±0.114) 37.11±2.924) 0.87±0.11乙酸乙酯提取物高劑量組300 1.72±0.14 41.18±1.781) 3.75乙酸乙酯提取物低劑量組150 1.64±0.17 40.39±4.021) 4.25±0.134) 32.83±1.101) 0.99±0.71正丁醇提取物高劑量組 100 1.82±0.064) 45.69±3.623) 3.45±0.064) 51.16±1.462)4) 0.20±0.113)正丁醇提取物低劑量組 50 1.79±0.123) 42.34±1.541) 4.04±0.334) 40.89±0.674) 0.31±0.073)

2.4 對衰老模型小鼠海馬細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

經(jīng)HE染色后，光學(xué)顯微鏡下正常細(xì)胞核呈均一淡藍(lán)色或藍(lán)色，胞質(zhì)呈淡紅色，胞膜完整連續(xù)。異常組織則細(xì)胞變圓變小，胞核固縮、碎裂，出現(xiàn)局部深染，不均勻，或者核分散消失而不見核染色。正常對照組海馬區(qū)細(xì)胞排列整齊，層次緊密，形態(tài)完整，細(xì)胞邊緣清晰，染色均勻，核仁深染;模型組細(xì)胞數(shù)量較少，細(xì)胞間隙增長，排列疏松不齊，大部分細(xì)胞核仁淺染，染色質(zhì)不均勻，少量神經(jīng)細(xì)胞的圓形胞核體

組織石蠟切片積減小，固縮，有的甚至消失、核膜皺縮;芡實(shí)乙醇提取物高、低劑量組與正常對照組和模型組相比，細(xì)胞數(shù)量增多，大部分細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞邊緣清晰，染色質(zhì)均勻，核仁深染。芡實(shí)乙酸乙酯提取物高、低劑量組：與模型組相比，細(xì)胞數(shù)量增多，但與正常組相比，細(xì)胞數(shù)目有所減少，大部分細(xì)胞排列整齊，層次緊密，核仁深染;芡實(shí)正丁醇提取物高、低劑量組：與正常組和模型組相比，細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞排列整齊，層次緊密，核仁深染 (見圖1)。

圖1 各組小鼠海馬區(qū)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變(HE，×200)

3 討論

與其他幾種衰老動(dòng)物模型相比，D-半乳糖衰老動(dòng)物模型造模方法簡便易行，價(jià)格低廉，結(jié)果穩(wěn)定，已成為國內(nèi)公認(rèn)的衰老動(dòng)物模型，在抗衰老藥物研究等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。D-半乳糖致衰老的作用機(jī)制為：一方面，半乳糖在其氧化酶的作用下，氧參與反應(yīng)，生成二醛糖及H2O2，且半乳糖在體內(nèi)亦可發(fā)生非酶糖基化反應(yīng)，產(chǎn)生蛋白質(zhì)交聯(lián);另一方面，半乳糖在醛糖還原酶的催化下還原成半乳糖醇，該物質(zhì)不能被細(xì)胞進(jìn)一步代謝而堆積在細(xì)胞內(nèi)，影響正常滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹和功能障礙，最終引起衰老〔5〕。

近年來的研究表明，基因p53與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系。p53基因是一種重要的抑癌基因，編碼393個(gè)氨基酸組成的含磷蛋白質(zhì)。體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，伴隨著p53基因的高水平表達(dá)。p53一般通過3個(gè)步驟造成細(xì)胞凋亡：①通過轉(zhuǎn)錄誘發(fā)氧化還原基因;②制造活性氧因子;③氧化破壞線粒體的細(xì)胞膜，使細(xì)胞死亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示D-半乳糖致衰老小鼠腦組織海馬區(qū)細(xì)胞數(shù)量較少，出現(xiàn)異常細(xì)胞，呈現(xiàn)凋亡特征;促凋亡基因p53蛋白顯著表達(dá)。而幾種芡實(shí)提取物能明顯抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，減少促凋亡基因p53蛋白的表達(dá)，甚至達(dá)到正常水平。這進(jìn)一步從病理學(xué)角度提供了芡實(shí)能夠改善D-半乳糖致小鼠腦衰老情況的證據(jù)。

自由基理論是衰老的基本理論，大量實(shí)驗(yàn)表明衰老尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的衰老大部分與自由基及其中間產(chǎn)物的毒性有關(guān)。實(shí)際上，衰老過程與自由基的過量生成及它們的濃度與抗氧化系統(tǒng)的平衡密切相關(guān)。在正常生理?xiàng)l件下，自由基及其中間產(chǎn)物的產(chǎn)生(如 MDA、NO等)與抗氧化系統(tǒng)(如SOD、GSH等)保持著一定的平衡，但是，隨著衰老過程的進(jìn)程，這個(gè)平衡被打破，以至于活性氧大量產(chǎn)生，抗氧化系統(tǒng)逐漸減弱。芡實(shí)中含有大量黃酮〔6〕類強(qiáng)抗氧化劑，從而能夠消除體內(nèi)過量自由基，避免生物大分子的損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，D-半乳糖致衰老小鼠腦組織中MDA含量顯著高于正常小鼠，T-AOC、SOD、GSH-Px活性顯著低于正常小鼠。但是，給予一定劑量芡實(shí)各提取物后，小鼠腦組織中自由基中間產(chǎn)物MDA的含量顯著減少，能顯著提高抗氧化系統(tǒng)相關(guān)酶SOD、GSH-Px的活性，起到延緩衰老的作用。其中，就芡實(shí)幾種提取物對抗氧化系統(tǒng)這幾個(gè)指標(biāo)的影響來看，對GSH-Px活性的增強(qiáng)效果最佳。

綜上所述，所有研究結(jié)果證實(shí)D-半乳糖能導(dǎo)致小鼠呈現(xiàn)衰老跡象，產(chǎn)生一系列應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)自由基的形成、引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡和退化，最終導(dǎo)致小鼠衰老。而給以一定劑量的芡實(shí)提取物，能減少促凋亡基因p53蛋白的表達(dá)，并通過降低腦組織中MDA含量，同時(shí)提高T-AOC、SOD和GSH-Px的活性及抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)揮其延緩腦衰老的功效。其中正丁醇提取物高、低兩個(gè)劑量對所有不良反應(yīng)的改善效果最佳。雖然幾種芡實(shí)提取物不能同時(shí)很好地改善D-半乳糖引起的所有指標(biāo)的變化，但從影響腦組織中某些相關(guān)生化指標(biāo)的結(jié)果，也能看出其改善腦衰老情況的作用，進(jìn)一步的機(jī)制研究仍在進(jìn)行中。

1 劉玉鵬，劉 梅，劉俊英，等.30種中草藥的抗氧化活性研究〔J〕.煙臺大學(xué)學(xué)報(bào)，2000;13(1)：70-3.

2 Samarjit D，Eter D，Utpal R.The effect of Euryale ferox(makhana)，an herb of aquatic origin，on myocardial ischemicreperfusion injury〔J〕.Mol Cell Biochem，2006;289：55-63.

3 王婉鋼，張曉平，古 青，等.芡實(shí)對中風(fēng)后遺癥康復(fù)的影響〔J〕.湖北中醫(yī)雜志，2010;32(2)：16-7.

4 朱亞珍，朱虹光.D-半乳糖致衰老動(dòng)物模型的建立及其檢測方法〔J〕.復(fù)旦學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2007;34(4)：617-9.

5 李文彬，韋 豐，范 朋，等.D-半乳糖在小鼠上誘導(dǎo)的擬腦老化效應(yīng)〔J〕.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，1995;9(2)：93-5.

6 李美紅，楊雪瓊，萬直劍，等.芡實(shí)的化學(xué)成分〔J〕.中國天然藥物，2007;5(1)：24-6.

Effect and mechanisms of Euryale ferox seed extracts on the expression of p53 protein in the brain of aging mice

SHEN Bei，WU Qi-Nan，WU Cheng-Ying，et al.
Pharmaceutical College of Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210046，Jiangsu，China

Objective To investigate the deferring aging effect and the associated mechanisms of Euryale ferox seed extracts on indexes of oxidation system and the expression of p53 protein in the brain of aging mice induced by D-gal.Methods 104 male Kunming mice were divided randomly into the normal control，D-gal model，high and low dose of ethanol，acetic ester and n-butanol extracts from Euryale ferox seed groups.All animals were administered by corresponding medicine for 6 weeks.The activities of total antioxidant capacity(TAOC)，superoxide dismutase(SOD)，glutathione peroxidase(GSH-Px)and malondialdehyde(MDA)in brain were detected.HE stain and immunohistochemistry techniques were performed to determine the form of hippocampal nerve cells and the expression of p53 protein in the brain choroid.Results Compared with the model group，Euryale ferox seed extracts could increase the activities of T-AOC，SOD and GSH-Px(P ＜0.05，P ＜0.01)，reduce MDA(P ＜ 0.05，P ＜0.01)with dose-dependent tendency，prevent hippocampal nerve cells from damaging obviously and down-regulate the expression of p53 protein(P＜0.05).Conclusions Euryale ferox seed extracts can down-regulate the expression of p53 protein.The mechanisms may be related to scavenging free radicals and preventing hippocampal nerve cells from damaging.

Euryale ferox seed extracts;Aging mice;Antioxidant;p53 protein

R394

A

1005-9202(2012)23-5156-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.027

國家十二五支撐計(jì)劃項(xiàng)目(No.2011BAI04B06);江蘇省高校中藥資源與化學(xué)研究科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(2011);江蘇省六大人才高峰項(xiàng)目(2009)

吳啟南(1963-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥品質(zhì)評價(jià)研究。

沈 蓓(1988-)，女，在讀碩士，主要從事中藥品質(zhì)評價(jià)研究。

〔2012-07-19收稿 2012-10-10修回〕

(編輯 曹夢園)