張 維，李雪雁，張秀蘭，胡志明，李 冰

（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730050）

響應(yīng)面分析法優(yōu)化菊芋渣中蛋白的提取工藝

張 維，李雪雁*，張秀蘭，胡志明，李 冰

（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730050）

以菊芋渣為研究對象，用蛋白質(zhì)提取率作為衡量提取工藝的指標(biāo)。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取pH、提取溫度、提取時(shí)間為自變量，蛋白提取率為響應(yīng)值，利用Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理和響應(yīng)面分析法，研究各自變量及其交互作用對提取率的影響，模擬得到二次多項(xiàng)式回歸方程的預(yù)測模型，在固液比為1∶30（g/mL）的條件下，確定最佳提取條件為pH14.0、提取溫度82℃、提取時(shí)間2h。在此條件下，平均蛋白提取率為22.7747mg/g。與理論預(yù)測值23.3187mg/g相比，其相對誤差約為2.33%。說明通過響應(yīng)面優(yōu)化后得出的回歸方程具有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

菊芋渣，蛋白，提取，響應(yīng)面分析法

菊芋（俗稱洋姜）是多年生菊科植物，我國南北各地均有種植。它除了含菊糖外，還含有一定數(shù)量的蛋白質(zhì)、果膠、纖維素及其他成分。目前對菊芋的研究主要集中在以下幾個(gè)方面：菊芋中菊粉的提取，純化和功能；菊芋葉中活性成分的研究；菊芋治理沙漠的研究；微生物產(chǎn)菊粉酶的研究等。而菊芋加工后的副產(chǎn)品菊芋渣中粗蛋白含量達(dá)9.6%[1]（相對干基），粗脂肪含量1.6%，是各種畜禽的良好飼料。1t菊芋塊莖加工后可得菊芋渣650kg[1]（水分含量約為83%），如若長期堆棄，不僅污染環(huán)境，而且會造成資源的浪費(fèi)。本實(shí)驗(yàn)著重對菊芋渣蛋白質(zhì)的提取工藝進(jìn)行了研究，得到了菊芋渣蛋白質(zhì)的最佳提取條件，為今后菊芋蛋白質(zhì)的大規(guī)模生產(chǎn)和其產(chǎn)品的深加工提供了可行性依據(jù)，對菊芋的綜合利用及新產(chǎn)品的開發(fā)提供基礎(chǔ)研究資料。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菊芋渣 白銀熙瑞生物工程有限公司提供；鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇、磷酸 均為分析純；考馬斯亮藍(lán)G-250 上海綠鳥科技發(fā)展公司；所用其他試劑均為分析純。

TGL-16C高速臺式離心機(jī) 上海安亨科學(xué)儀器廠；722s可見光分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；HHS電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ALC-110.4電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；85-2磁力攪拌器 上海浦東物理光學(xué)儀器廠；PHS-3C pH計(jì) 上海偉業(yè)儀器廠；FD-1型冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分離蛋白的提取工藝流程 菊芋渣→干燥（自然風(fēng)干）→粉碎（60目）→攪拌浸提→離心（3000r/min）→取上清液→調(diào)pH至等電點(diǎn)→離心 （4000r/min）→取沉淀→調(diào)pH至7.0→透析脫鹽→真空凍干→粗蛋白粉

1.2.2 提取工藝最優(yōu)參數(shù)的確定 在單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，用菊芋渣與菊芋干粉的蛋白提取率作對照，依次改變菊芋渣堿提液的pH、溫度和堿提時(shí)間，以菊芋渣蛋白得率作為評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行研究和分析，并確定三因素三水平的最佳參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面分析[2-4]。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的水平及編碼表見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.2.3 蛋白提取率的測定 蛋白提取率（mg/g）=提取液中蛋白質(zhì)總蛋白質(zhì)量（mg）/原料的總質(zhì)量（g）

提取液中蛋白質(zhì)含量測定：采用考馬斯亮藍(lán)法[5]。取0.1mL提取液，加入考馬斯亮藍(lán)染液5mL，混勻，靜置3min，在波長595nm處測吸光度；依蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程y=0.3761x-0.0085（R2=0.9961）計(jì)算可溶性蛋白的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 堿液pH對菊芋蛋白提取率的影響 堿液浸提菊芋渣過程中控制體系的溫度80℃、料液比1∶30（g/mL）、浸提時(shí)間60min，設(shè)置不同pH的堿液。堿液pH對菊芋渣蛋白提取的影響結(jié)果見圖1。蛋白質(zhì)溶解度隨pH升高而增大，蛋白質(zhì)溶出增多。從圖1可知，隨著堿液pH增加，蛋白提取率呈增加的趨勢，其中pH為13.5時(shí)蛋白提取率最高，而后蛋白含量趨于穩(wěn)定。而菊芋干粉在pH為13時(shí)，蛋白提取率達(dá)到最高，可見菊芋的加工過程使其中蛋白的堿耐受性增加。綜合考慮兩評價(jià)指標(biāo)的最佳pH，選取pH13、13.5、14繼續(xù)對菊芋渣蛋白的提取做響應(yīng)面分析以確定最佳的堿液pH。

圖1 pH對菊芋蛋白提取率的影響Fig.1 Influence of pH value on Jerusalem artichoke protein extraction rate

2.1.2 浸提溫度對菊芋蛋白提取率的影響 用堿液浸提菊芋蛋白過程中控制體系pH13.5、浸提時(shí)間60min、料液比1∶30（g/mL），設(shè)置不同的溫度，研究浸提溫度對菊芋渣蛋白提取率的影響見圖2。從圖2可知，隨著溫度的升高，蛋白提取率逐漸提高，80℃以上蛋白提取率趨于不變；蛋白提取率隨溫度升高，先升高再趨于穩(wěn)定，80℃時(shí)蛋白提取率最高。而且菊芋干粉的蛋白提取率也在80℃時(shí)趨于穩(wěn)定。綜合考慮兩評價(jià)指標(biāo)確定溫度為70、80、90℃繼續(xù)對菊芋渣蛋白的提取做響應(yīng)面分析以確定最佳的浸提溫度。

圖2 提取溫度對菊芋蛋白提取率的影響Fig.2 Influence of extracting temperature on Jerusalem artichoke protein extraction rate

2.1.3 浸提時(shí)間對菊芋蛋白提取率的影響 堿液浸提菊芋蛋白過程中控制體系的溫度80℃、料液比1∶30（g/mL）、堿液pH13.5，設(shè)置不同的浸提時(shí)間，研究浸提時(shí)間對菊芋渣蛋白制備的影響，結(jié)果見圖3。如圖3所示，蛋白提取率隨著時(shí)間的增加而增加，2h以后提取率開始下降，而蛋白提取率隨時(shí)間增加先提高再下降。這個(gè)過程可能是浸提時(shí)間延長，蛋白的溶出增加，一定時(shí)間后，蛋白的溶出達(dá)到飽和，則溶出率趨于平衡，若再進(jìn)一步延長浸提時(shí)間，可能因?yàn)槲⑸锷L等因素使蛋白質(zhì)變性從而使提取率降低。而菊芋干粉中蛋白的溶出則在1h時(shí)達(dá)到飽和。綜合評價(jià)兩指標(biāo)的最佳浸提時(shí)間段，選取1、2、3h繼續(xù)做響應(yīng)面分析以確定最佳的浸提時(shí)間。

圖3 提取時(shí)間對菊芋蛋白提取率的影響Fig.3 Influence of extracting time on Jerusalem artichoke protein extraction rate

2.1.4 料液比對菊芋蛋白提取率的影響 堿液浸提菊芋渣蛋白過程中控制體系的溫度80℃、浸提時(shí)間2h、堿液pH13.5，設(shè)置不同的料液比，研究料液比對菊芋渣蛋白制備的影響，結(jié)果見圖4。如圖4所示，菊芋干粉蛋白提取率隨堿液量的增加變化不大，而菊芋渣蛋白提取率則隨堿液量增加而提高。從圖4可以看出，在料液比1∶30（g/mL）左右，蛋白溶解較為充分。

圖4 固液比對菊芋蛋白提取率的影響Fig.4 Influence of solid-liquid ratio on Jerusalem artichoke protein extraction rate

2.2 響應(yīng)面法提取條件的優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken[6]中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合分析單因素實(shí)驗(yàn)，確定提取料液比為1∶30，選取對菊芋渣蛋白提取影響顯著的3個(gè)因素（pH、提取溫度、提取時(shí)間），設(shè)計(jì)了3因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Results of response surface experiments

使用Design Expert7.0軟件，以pH、提取溫度、提取時(shí)間為響應(yīng)變量，以菊芋渣蛋白提取率為響應(yīng)值（指標(biāo)值）對表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到表3回歸方程方差分析表，利用軟件進(jìn)行非線性回歸的二次多項(xiàng)式擬合，得到預(yù)測模型如下：Y=18.63+5.38A+0.80B+ 0.44C+0.68AB+0.55AC-0.26BC-0.88A2-0.44B2-4.25C2

表3為回歸分析結(jié)果，回歸方差分析顯著性檢驗(yàn)表明，該模型回歸顯著（p＜0.0001），失擬項(xiàng)不顯著，并且該模型R2=0.9953，R2Adj=0.9893，說明該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合較好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可以用于菊芋渣蛋白提取工藝實(shí)驗(yàn)的預(yù)測。

方差分析結(jié)果還表明，方程的一次項(xiàng)中A、B對響應(yīng)值的影響顯著，二次項(xiàng)A（pH）、B（提取溫度）、C（浸提時(shí)間）對響應(yīng)值的影響顯著。由此可見，各具體實(shí)驗(yàn)因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。

各因素的影響程度分析，各因素的F值可以反映出各因素對實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的重要性，F(xiàn)值越大，表明對實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響越大，即重要性越大。從方差分析表可知：FA=615.09，F(xiàn)B=13.50，F(xiàn)C=4.19，即各因素對堿溶性蛋白提取率的影響程度大小順序?yàn)椋簆H＞提取溫度＞提取時(shí)間。

根據(jù)回歸方程，做出響應(yīng)面分析圖（圖5～圖7），考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀，分析pH、提取溫度、提取時(shí)間對菊芋渣蛋白提取率的影響。

2.2.2 各因素之間的交互作用 見圖5～圖7。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis results of regression and variance

圖5 pH和提取溫度對蛋白提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface of pH and extraction temperature on the extraction rate of protein

圖6 提取時(shí)間和pH對蛋白提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface of pH and extraction time on the extraction rate of protein

2.2.3 提取工藝條件的驗(yàn)證 為進(jìn)一步確定最佳點(diǎn)，在模型濃度范圍內(nèi)選擇出發(fā)點(diǎn)，使用快速上升法進(jìn)行優(yōu)化得到的菊芋蛋白提取的最佳方案為：pH14.00，提取溫度81.79℃，提取時(shí)間：2.11h，菊芋渣蛋白得率23.3187mg/g。為檢驗(yàn)響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性采用上述優(yōu)化提取條件提取南瓜多糖，考慮到實(shí)際操作的便利，將提取工藝參數(shù)修正為pH14.0，提取溫度82℃，提取時(shí)間2h。以上述條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證，重復(fù)3次實(shí)際測得的蛋白得率分別為22.6252、23.1173、22.5890mg/g，平均蛋白得率為22.7747mg/g。與理論預(yù)測值相比，其相對誤差約為2.33%。說明通過響應(yīng)面優(yōu)化后得出的回歸方程具有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

圖7 提取時(shí)間和提取溫度對蛋白提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface of extraction time and extraction temperature on the extraction rate of protein

3 結(jié)論

采用堿提的方法對菊芋渣中蛋白質(zhì)進(jìn)行提取，通過單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理以及響應(yīng)面分析法對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，擬合了pH、提取溫度、提取時(shí)間這3個(gè)因素對蛋白的原料提取率的回歸模型，經(jīng)檢驗(yàn)證明該模型合理可靠，能較好地預(yù)測菊芋渣中堿溶性蛋白的原料提取率。由該模型確定的最優(yōu)工藝條件為pH14.0，提取溫度82℃，提取時(shí)間2h。在此條件下，得到菊芋渣平均蛋白得率為22.7747mg/g。通過模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，得到因素的主效應(yīng)關(guān)系為：pH＞提取溫度＞提取時(shí)間。

同時(shí)，在單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)與菊芋干粉做了對照實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明雖然菊芋干粉中堿溶性蛋白的提取率比菊芋渣的高，但從資源充分利用的角度來看，菊芋渣還是具有很大的開發(fā)潛力。目前，國內(nèi)外對菊芋渣的研究未見報(bào)道，因此，為了充分開發(fā)利用菊芋渣蛋白這一植物蛋白資源，仍需加大科研力度，完善菊芋蛋白提取分離基本理論和方法，滿足工業(yè)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的要求。

[1]秦亞兵，徐長警，王華，等.寧夏興建菊芋系列產(chǎn)品加工業(yè)的構(gòu)想與建議[J].寧夏農(nóng)林科技，2004（1）：31-35.

[2]矯麗媛，呂敬軍，陸豐升，等.花生分離蛋白提取工藝優(yōu)化研究[J].食品科學(xué)，2010，20（31）：196-201.

[3]李明妹，姚開，賈冬英.堿提酸沉法制備花生分離蛋白的優(yōu)化條件[J].中國油脂，2004，29（11）：21-23.

[4]陳學(xué)玲，羅金國，何建軍，等.大豆11S球蛋白提取分離方法研究[J].中國糧油學(xué)報(bào)，2007，22（1）：160-163.

[5]趙英永，戴云，崔秀明，等.考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定草烏中可溶性蛋白質(zhì)含量[J].云南民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，15（3）：235-237.

[6]BOXG E P，BEHNKEN D W.Some new three level designs for the study of quantitative variables[J].Technometrics，1960（2）：455-475.

Optimization of extraction conditions of protein from Jerusalem artichoke residue by response surface methodology

ZHANG Wei，LI Xue-yan*，ZHANG Xiu-lan，HU Zhi-ming，LI Bing
（School of Life Science and Engineering，Lanzhou University of Science and Technology，Lanzhou 730050，China）

Jerusalem artichoke residue as the research object，with the protein extraction rate as a measure indicator.Three extraction parameters including pH，extraction temperature and extraction time were optimized using central composite design and response surface methodology based on single factor investigations for achieving maximum the protein extraction rate.The interaction of the respective variables and their influence on the extraction rate were studied by using Box-Benhnken central composite design and response surface analysis theory，the simulated quadratic polynomial regression equation of prediction model was set up.Under the condition of solid-liquid ratio1∶30（g/mL），the optimum extraction condition for pH14，extraction temperature 82℃，extraction time of 2h.Under these conditions，the average protein yield ratio was 22.7747mg/g，compared to the theoretical value，the relative error of 2.33%.Optimized by response surface regression equation derived some practical significance.

Jerusalem artichoke residue；protein；extraction；response surface analysis

TS255.1

B

1002-0306（2012）01-0305-04

2011－01－17 *通訊聯(lián)系人

張維（1986-），男，碩士，研究方向：應(yīng)用分子酶學(xué)。

甘肅省教育廳研究生導(dǎo)師基金項(xiàng)目（0908ZTB011）。