高小朋，蘇 青，程同培

（延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西延安716000）

腌制酸菜中亞硝酸鹽降解菌的篩選及其降解特性研究

高小朋，蘇 青，程同培

（延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西延安716000）

通過劃線分離、格里斯試劑比色法、紫外分光光度法測(cè)定，從陜北地區(qū)的酸菜水中篩選得到11株亞硝酸鹽降解菌，經(jīng)過測(cè)定，菌株SQ-4可以高效降解亞硝酸鹽，降解率可達(dá)97.60%。通過檢測(cè)硝酸鹽和VC含量可知，該菌株并未通過代謝活動(dòng)將亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為硝酸鹽，同時(shí)產(chǎn)生了一定量的VC。

亞硝酸鹽，降解，菌株，VC

有研究表明，長(zhǎng)期食用自制酸菜會(huì)導(dǎo)致食道癌和胃癌的發(fā)生，其原因主要是酸菜腌制過程中產(chǎn)生大量的亞硝酸鹽，使酸菜中的亞硝酸鹽含量超標(biāo)[1]，過量的亞硝酸鹽能夠與胃內(nèi)食物中的仲胺類物質(zhì)相互作用，轉(zhuǎn)化為亞硝胺而引發(fā)癌癥[2]，更為嚴(yán)重的是，食入0.3～0.5g亞硝酸鹽即可引起中毒甚至死亡[3-5]。陜北地區(qū)人民有常年食用自制酸菜的習(xí)慣，本實(shí)驗(yàn)從陜北地區(qū)長(zhǎng)期腌制酸菜的酸菜水中篩選出可以降解亞硝酸鹽的菌株，對(duì)酸菜中的亞硝酸鹽進(jìn)行降解，并對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株改變酸菜的風(fēng)味、提高營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行了探討，以期為減少該地區(qū)因長(zhǎng)期食用自制酸菜而引發(fā)的食道癌和胃癌的發(fā)生和生產(chǎn)腌制食品中降低亞硝酸鹽含量的研究提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試水樣 延安寶塔區(qū)、榆林佳縣等地腌制酸菜的酸菜水；培養(yǎng)基 篩選培養(yǎng)基[6]、LB培養(yǎng)基[7]；對(duì)氨基苯磺酸、N-1-萘基乙二胺、2，6-二氯酚靛酚、Ag2SO4均為分析純。

隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 PYX-DHS-40*50-BS，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；紫外分光光度計(jì) UVmini-1240，日本島津；立式壓力蒸汽滅菌鍋 LS-B50L，江陰濱江醫(yī)療儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 亞硝酸鹽降解菌的篩選

1.2.1.1 初篩 無(wú)菌操作將取得的酸菜水水樣在篩選培養(yǎng)基平板上劃線分離，挑取單菌落，多次重復(fù)，將純化得到的菌株于（4±1）℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 復(fù)篩 將初篩得到的菌株利用格里斯試劑比色法[8]檢測(cè)菌株對(duì)亞硝酸鹽的降解情況，選擇降解率較高的菌株作為下一步的實(shí)驗(yàn)菌株。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)菌株降解亞硝酸鹽能力的檢測(cè)

1.2.2.1 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 參照文獻(xiàn)[6]。

1.2.2.2 培養(yǎng)液中亞硝酸鹽含量的測(cè)定 取20mg/mL NaNO2溶液1mL加入到100mL篩選培養(yǎng)基中（培養(yǎng)液中NaNO2濃度為200mg/L），各實(shí)驗(yàn)組加入復(fù)篩得到的菌株培養(yǎng)液5%，另取一組不加菌液作為空白對(duì)照，（35±1）℃靜置培養(yǎng)7d，每隔24h各取適量培養(yǎng)液，8000r/min離心15min，取一定量上清，按白雪娟等[8]的方法，測(cè)定各樣品的OD550，根據(jù)1.2.2.1繪制的NaNO2標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算出各組樣品中NaNO2的殘留量。

1.2.2.3 亞硝酸鹽降解率的測(cè)定 根據(jù)以下公式可計(jì)算出不同實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)NaNO2的降解率：

式中：X0—不同培養(yǎng)時(shí)刻空白組樣品中NaNO2含量；X1—不同培養(yǎng)時(shí)刻實(shí)驗(yàn)組樣品中NaNO2殘留量。

根據(jù)各實(shí)驗(yàn)菌株不同培養(yǎng)時(shí)刻的降解率，選出降解率最高的一株為本研究的目的菌株，同時(shí)，繪制目的菌株對(duì)亞硝酸鹽的降解曲線。

1.2.3 亞硝酸鹽去向的研究 培養(yǎng)液中的亞硝酸鹽減少后，可能被實(shí)驗(yàn)菌株吸收利用，也可能被氧化為硝酸鹽，為了得知亞硝酸鹽的去向，在培養(yǎng)不同時(shí)刻測(cè)定亞硝酸鹽的同時(shí)，還需測(cè)定培養(yǎng)液中硝酸鹽的含量。

取1.2.2.2中第一步得到的濾液10mL，采用鋅粒還原法[9]測(cè)定培養(yǎng)液中硝酸鹽含量，根據(jù)NaNO2標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濾液中還原后NaNO2總的含量，根據(jù)以下公式計(jì)算濾液中NaNO3含量：

X=（XB-XA）×1.232

式中：XA—不同培養(yǎng)時(shí)刻樣品中NaNO2含量；XB—不同培養(yǎng)時(shí)刻樣品中經(jīng)還原后NaNO2總含量；X—試樣中NaNO3含量。

以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以NaNO3含量為縱坐標(biāo)，繪制培養(yǎng)液中NaNO3含量變化曲線。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)菌株降解亞硝酸鹽產(chǎn)生維生素C的研究 實(shí)驗(yàn)菌株不僅要降低酸菜水中亞硝酸鹽的含量，還要能增加酸菜的營(yíng)養(yǎng)，主要研究了酸菜水中維生素C的變化情況，維生素C含量測(cè)定采用2，6-二氯酚靛酚滴定法[10]，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、以維生素C含量為縱坐標(biāo)，繪制不同培養(yǎng)時(shí)刻維生素C的含量曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞硝酸鹽降解菌的篩選結(jié)果

將取得的酸菜水水樣在篩選培養(yǎng)基固體平板上多次劃線分離后，得到22株菌，利用格里斯試劑比色法[8]初步篩選出具有降解亞硝酸鹽能力的實(shí)驗(yàn)菌株11株，分別編號(hào)為SQ-1、SQ-2、SQ-3、SQ-4、SQ-5、SQ-6、SQ-7、SQ-8、SQ-9、SQ-10、SQ-11。

2.2 實(shí)驗(yàn)菌株降解亞硝酸鹽能力的測(cè)定結(jié)果

2.2.1 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用1.2.2.1的方法，繪制出的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

圖1 NaNO2標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of NaNO2

由繪制所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.4772x+0.0052，相關(guān)系數(shù)R2=0.9984，擬合度較好，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的樣品測(cè)定。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)菌株降解亞硝酸鹽能力的測(cè)定結(jié)果 根據(jù)1.2.2.2和1.2.2.3的測(cè)定方法，各實(shí)驗(yàn)菌株培養(yǎng)7d時(shí)對(duì)NaNO2的降解情況如圖2。

由圖2可知，11株實(shí)驗(yàn)菌株除SQ-7外，其他菌株都對(duì)NaNO2有較高的降解率，其中SQ-4、SQ-5、SQ-9、SQ-10降解率都達(dá)到了80%以上，SQ-4降解率最高，達(dá)到了97.6%，因此，選擇SQ-4作為此次研究的目的菌株，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D550為縱坐標(biāo)，繪制出菌株SQ-4在不同培養(yǎng)時(shí)刻對(duì)NaNO2降解曲線如圖3。

圖2 各實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)NaNO2的降解率Fig.2 The degradation rates of strains to NaNO2

圖3 菌株SQ-4對(duì)NaNO2的降解曲線Fig.3 Degradation curve of SQ-4 to NaNO2

由圖3可知，在開始0～5d，培養(yǎng)液中NaNO2含量急劇降低，第5d后趨于平緩，并且在第7d NaNO2幾乎全部消失，其降解率可達(dá)97.60%；而未加菌的對(duì)照組NaNO2含量略有下降，這可能是由于空氣中的氧將部分NaNO2氧化所致。

2.3 亞硝酸鹽去向的研究結(jié)果

培養(yǎng)液中的NaNO2含量明顯降低，可能被實(shí)驗(yàn)菌株吸收利用，也可能被氧化為硝酸鹽，經(jīng)過測(cè)定，不同培養(yǎng)時(shí)刻培養(yǎng)液中NaNO2和NaNO3含量變化情況如圖4。

圖4 NaNO2和NaNO3含量變化曲線Fig.4 The content change of NaNO2and NaNO3

由圖4可知，在培養(yǎng)過程中，NaNO2含量明顯下降，而NaNO3卻沒有明顯變化，由此可知，減少的NaNO2并沒有被轉(zhuǎn)化為NaNO3，可能轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)或是被SQ-4在生長(zhǎng)過程中利用轉(zhuǎn)化為自身的物質(zhì)。

2.4 菌株SQ-4產(chǎn)維生素C的研究

采用2，6-二氯酚靛酚滴定法測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)刻培養(yǎng)液中的VC的含量，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以VC的含量為縱坐標(biāo)，得到VC含量變化情況如圖5。

圖5 SQ-4產(chǎn)VC曲線Fig.5 The content curve of VCproduced by SQ-4

由圖5可知，菌株SQ-4在利用NaNO2的過程中，能夠產(chǎn)生VC，并且其含量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，這有助于增加酸菜的營(yíng)養(yǎng)，改善酸菜的風(fēng)味。

3 結(jié)論

3.1 本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過篩選得到11株對(duì)亞硝酸鹽具有降解能力的菌株，通過測(cè)定得知，菌株SQ-4在培養(yǎng)0～5d時(shí)，亞硝酸鹽迅速下降，7d時(shí)亞硝酸鹽含量降至最低，降解率高達(dá)97.60%。

3.2 通過還原法測(cè)定培養(yǎng)液中硝酸鹽含量，可知實(shí)驗(yàn)菌株在降低亞硝酸鹽的過程中，并沒有將亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽，而是將亞硝酸鹽吸收利用轉(zhuǎn)化為菌體自身的物質(zhì)或者轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)。

3.3 實(shí)驗(yàn)菌株在利用亞硝酸鹽的過程中，可以產(chǎn)生維生素C，而且維生素C的含量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，由此可知，菌株SQ-4不僅可以降低酸菜水中的亞硝酸鹽，而且還可以實(shí)現(xiàn)改善酸菜風(fēng)味，增加營(yíng)養(yǎng)的功效。

[1]衛(wèi)生部.衛(wèi)生部關(guān)于2005年全國(guó)食物中毒事件報(bào)告情況的通報(bào)[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2006，18（3）：269.

[2]惠永倩.強(qiáng)化學(xué)致癌物—N-亞硝基化合物[J].人民軍醫(yī)，1982，15（1）：25-27.

[3]丁之恩.亞硝酸鹽與亞硝胺在食品中的作用及其機(jī)理[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，19（2）：199-205.

[4]吳暉，劉冬梅，余以剛，等.泡菜中亞硝酸鹽的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代食品科技，2007，23（7）：63-64.

[5]朱效兵，石晶紅.亞硝酸鹽與人體健康[J].河套大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，4（4）：67-68.

[6]夏巖石，孫春鳳.乳酸菌降解亞硝酸鹽的動(dòng)態(tài)研究[J].湖南科技學(xué)報(bào)，2008，29（8）：44.

[7]周德慶.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].第二版.北京：高等教育出版社，2006：372.

[8]白雪娟，徐世眾.格里斯試劑比色法測(cè)定肉制品中亞硝酸鹽含量[J].肉類工業(yè)，2008（7）：46-47.

[9]肖義夫，廖百森，趙艦，等.鋅粒還原法快速測(cè)定食品中的硝酸鹽[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2003，15（4）：316.

[10]王秀奇.基礎(chǔ)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京：高等教育出版社，2005：195-199.

Study on isolation of one bacterial strain capable of nitrite degeneration from traditional pickled vegetable and its characteristics

GAO Xiao-peng，SU Qing，CHENG Tong-pei
（College of Life Science，Yan’an University，Yan’an 716000，China）

Eleven strains which could degradate nitrite were isolated from sour pickled cabbage water from northern region of Shaanxi.The degradation rate of strian SQ-4 was 97.60%，after detection，result showed the nitrite couldn’t be oxidated to nitrate by strian SQ-4 and produced Vitamin C in the process.

nitrite；degradation；stains；Vitamin C

TS201.1

A

1002-0306（2012）01-0198-03

2011－01－14

高小朋（1976-），男，講師，研究方向：資源與環(huán)境微生物學(xué)。