陶冬冰，孟憲軍，劉 彬

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽110086）

東北野生山榛子樹皮、樹葉、果皮中紫杉醇的超聲輔助提取方法研究

陶冬冰，孟憲軍，劉 彬

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽110086）

采用超聲提取法對東北野生山榛子樹的果皮、樹皮、樹葉進(jìn)行了紫杉醇的提取，通過單因素實驗和正交實驗得出了最佳的超聲輔助提取條件：乙醇濃度80%，超聲頻率300Hz，提取溫度50℃，料液比1∶3，提取時間60min，三種樣品（樹皮、果皮、樹葉）中紫杉醇的得率均為最大值。果皮中的提取率為0.0059%，樹皮中的提取率為0.0048%，樹葉中的提取率為0.0033%，最終確定果皮中紫杉醇的含量gt;樹皮中紫杉醇的含量gt;樹葉中的紫杉醇的含量。

榛子，紫杉醇，超聲提取

榛子，屬樺木科榛屬植物，又稱山板栗、尖栗、棰子等[1]。在世界范圍內(nèi)榛屬有約20個品種，主要分布于亞洲、歐洲及北美洲；在中國境內(nèi)共有8個種類及2個變種，分布于東北、華東、華北、西北及西南地區(qū)[2]。榛子里包含著抗癌化學(xué)成分紫杉酚[3]，可以治療卵巢癌和乳腺癌以及其他一些癌癥，可延長病人的生命期[4]。目前，紫杉醇的來源主要有：天然紅豆杉植物提取、人工種植、化學(xué)半合成、化學(xué)全合成、生物合成、真菌發(fā)酵、植物組織細(xì)胞培養(yǎng)、基因工程[5]。迄今為止，紫杉醇的主要來源仍是從天然紅豆杉屬植物的莖皮中提取[6]。但是，由于紅豆杉生長緩慢，又極少成林，資源十分有限，要獲得1kg紫杉醇，需要104kg樹皮，約4000棵紅豆杉樹[7]。本文采用東北野生山榛子的樹皮及果皮進(jìn)行紫杉醇的提取，可以大大緩解紫杉醇提取原料的資源短缺問題，并對東北野生山榛子的綜合開發(fā)利用有一定的借鑒作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

野生山榛子樹 均采自于鐵嶺地區(qū)，分別取樹皮、樹葉和果皮自然風(fēng)干后粉碎，得到實驗樣品。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的預(yù)處理 取材為野生山榛子樹，分別取樹皮、樹葉及果皮，自然風(fēng)干后，通過粉碎機(jī)粉碎，然后過60目篩備用[8]。

1.2.2 超聲提取方法 分別稱取果皮、樹皮、枝葉預(yù)處理樣品100g，加80%乙醇的水溶液100mL[9]。選擇超聲的時間、超聲波的頻率、料液比、提取溫度4個因素進(jìn)行實驗[10]，考察這四個因素對紫杉醇超聲提取率的影響。將各因素取3水平，進(jìn)行4因素3水平正交實驗。超聲提取結(jié)束后，過濾，濾液40℃時減壓蒸去乙醇，得水溶液[11]。然后定容至100mL，準(zhǔn)確吸取5mL處理后的提取液，測定其吸光度值[12]。考察超聲波頻率、提取溫度、料液比、提取時間對提取結(jié)果的影響。

1.2.3 紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 顯色劑選用茴香醛-硫酸-乙醇（1∶3∶50，V/V），精確稱取紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品0.01g溶于50mL乙醇，使用可見-紫外分光光度計在190～300nm掃描以確定最大紫外吸收峰[13]。將上述溶液稀釋為0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008mg/L，在233nm波長處測定吸光度值，以乙醇為對照，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，紫外掃描圖譜顯示紫杉醇的最大吸收波長為233nm。得到回歸方程：y=0.023x+0.067，R2=0.9977。

圖1 紫杉醇測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of taxol detection

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

由于紫杉醇是一種復(fù)雜的二萜類化合物，難溶于水，不溶于石油醚，可溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷等有機(jī)溶劑，結(jié)合紫杉醇的溶解特性，本實驗重點考察了三種試劑：甲醇、乙醇、丙酮，試劑濃度為80%，超聲頻率300Hz，超聲時間60min，料液比1∶3，溫度50℃進(jìn)行提取實驗。

表1 不同提取溶劑對紫杉醇提取率的影響Table 1 Extraction rate of taxol with different extracting solvent

根據(jù)實驗結(jié)果顯示：丙酮提取液＞乙醇、甲醇提取液提取率，但是從食品級考慮其他溶劑均具有毒性，故選擇乙醇為提取溶劑。

2.2 超聲提取過程中不同因素對提取率的影響

圖2 超聲頻率對提取率的影響Fig.2 Ultrasonic frequency on extraction rate

2.2.1 超聲頻率對提取率的影響 在乙醇濃度為80%，溫度為50℃，提取時間60min，料液比l∶3的條件下，考察超聲波頻率對提取率的影響。由圖2可見，隨著超聲波功率的增加，三種樣品（果皮、樹皮、樹葉）吸光度逐漸增大，提取率逐漸增大，但是超聲波頻率大于250Hz后，吸光度值增加很少，提取率增量也隨之減小，同時考慮到經(jīng)濟(jì)性和超聲波頻率過高可能使原材料降低活性，所以選擇超聲波頻率范圍為200、250、300Hz。

2.2.2 溫度對提取率的影響 在超聲波頻率為300Hz，乙醇濃度80%，提取時間60min，料液比1∶3的條件下，考察提取溫度對紫杉醇提取的影響，結(jié)果表明（圖3），隨著溫度升高，三種樣品（果皮、樹皮、樹葉）吸光度值逐漸增加。但溫度過高（gt;40℃），吸光度值逐漸下降，提取率也緩慢下降，并在逐漸升溫后持續(xù)下降，所以選擇溫度范圍為30、40、50℃。

圖3 溫度對提取率的影響Fig.3 Temperature on extraction rate

2.2.3 料液比對提取率的影響 在超聲波頻率為300Hz，乙醇濃度為80%，提取溫度50℃，提取時間60min的條件下，考察料液比對紫杉醇提取率的影響。

圖4 料液比對提取率的影響Fig.4 Ratio of material to liquid on extraction rate

圖4的實驗結(jié)果表明，當(dāng)料液比≤1∶3時，三種樣品（果皮、樹皮、樹葉）吸光度值反而下降，這有可能是因為溶劑體積的增多使除紫杉醇以外的其他雜質(zhì)溶出，從而抑制紫杉醇的溶出。所以選擇料液比范圍為1∶2、1∶3、1∶4。

2.2.4 提取時間對提取率的影響 在料液比（g/mL）為1∶3，乙醇濃度80%，超聲波頻率為300Hz，溫度為50℃的條件下，考察提取時間對紫杉醇提取的影響。

實驗結(jié)果（圖5）表明，超聲波提取時間為60min時，提取效果最好。當(dāng)時間延長時，三種樣品（果皮、樹皮、樹葉）吸光度反而下降，這可能是由于超聲波的機(jī)械剪切作用，長時間加熱使大分子斷裂，在后處理中損失。從而使吸光度值降低，最后導(dǎo)致提取率的降低，所以選擇提取時間范圍為50、60、70min。

圖5 提取時間對提取率的影響Fig.5 Extracting time on extraction rate

2.3 正交實驗

根據(jù)以上單因素實驗結(jié)果，確定因素水平范圍如下：超聲頻率（A）分別為200、250、300Hz；料液比（B）分別為：1∶2、1∶3、1∶4；溫度（C）分別為：30、40、50℃；提取時間（D）分別為50、60、70min。

表2 正交實驗因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments

因三種原料得率具有一定規(guī)律，故只選取得率較高的果皮進(jìn)行四因素三水平正交實驗，正交實驗的結(jié)果如表3。

表3 正交實驗方案及結(jié)果分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments

從正交實驗可以看出：超聲頻率（A）對得率的影響最大，其次是料液比（B），之后是提取時間（D），最后是提取的溫度（C）。根據(jù)正交實驗得到的最佳工藝條件為：即頻率300Hz，料液比1∶3，超聲提取溫度為50℃，超聲提取時間為60min。

2.4 驗證實驗

根據(jù)正交實驗結(jié)果分別對果皮、樹皮、樹葉三種原料進(jìn)行驗證實驗，采用優(yōu)化后的條件：即乙醇濃度80%，頻率300Hz，料液比1∶3，超聲提取溫度為50℃，超聲提取時間為60min。進(jìn)行三次重復(fù)實驗，取平均數(shù)得到果皮中的紫杉醇提取率為0.0059%，樹皮中的提取率為0.0048%，樹葉中的提取率為0.0033%。

3 結(jié)論

本文通過超聲提取法提取了東北地區(qū)野生山榛子果皮、樹皮、樹枝中的紫杉醇含量，通過實驗選擇最佳條件為：乙醇濃度為80%，超聲頻率300Hz，料液比為1∶3，溫度為50℃，提取時間為60min。其中超聲頻率對于實驗結(jié)果影響最為顯著，提取的溫度相對影響比較小。

最后通過實驗結(jié)果綜合分析得出，果皮中紫杉醇的含量（0.0059%）高于樹皮中紫杉醇的含量（0.0048%）高于樹葉中紫杉醇的含量（0.0033%）。

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Study on ultrasonic extraction technology of taxol from leaves，bark，fruit peels of northeast wild hazel

TAO Dong-bing，MENG Xian-jun，LIU Bin
（Shenyang Agriculture University，Shenyang 110086，China）

This thesis adopts ultrasonic extraction method to extract the taxol from fruit peels，tree bark and tree leaves of the northeast wild hazel trees.According to single factor experiment and orthogonal experiment，the optimum ultrasound-associated extraction conditions were showed as follows：concentration of ethanol was 80%，ultrasonic frequency was 300Hz，extraction temperature was 50℃，RMV（ratio of material to liquid）was 1∶3 and extracting time was 1h.The taxol’s yield rates of three kinds of samples（tree bark，fruit peel，tree leaves）were all the maxima.The extraction rate of fruit peel was 0.0059%，the extraction rate of tree bark was 0.0048% and the extraction rate of tree leaves was 0.0033%.At last，it comes to the conclusion that the taxol content of fruit feel＞the taxol content of tree bark＞the taxol content of tree leaves.

hazelnut；taxol；ultrasonic extraction

TS255.1

B

1002-0306（2012）01-0299-03

2010－12－06

陶冬冰（1983-），男，碩士，實驗師，主要從事植物中生理活性物質(zhì)提取及功能性研究。