周一軍，李璦，宋雨凌，李妍，周慧

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院內(nèi)分泌科，沈陽 1 1 0 0 3 2）

2型糖尿病患者由于肥胖、脂代謝紊亂常存在血漿游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）水平增高［1］，長期的FFA水平升高可導(dǎo)致胰島素分泌障礙，是形成胰島素抵抗、胰島β細(xì)胞功能減退的重要環(huán)節(jié)［2］。研究顯示，GTP結(jié)合蛋白耦聯(lián)受體40（GTP-binding protein coupling receptor 40，GPR40）是中長鏈 FFA的特異性受體，主要在胰島β細(xì)胞和胰島素分泌細(xì)胞系大量表達(dá)，介導(dǎo)了FFA對β細(xì)胞的多種作用。GPR40是1個7次跨膜受體，它是G蛋白耦聯(lián)受體家族成員之一。GPR40以前從1個人類基因組片段中發(fā)現(xiàn)，曾被認(rèn)為是1種“孤兒”受體（1種未知配體的受體），不發(fā)揮生理功能。最近研究發(fā)現(xiàn)，GPR40通過介導(dǎo)β細(xì)胞Ca2+信號反應(yīng)參與了FFA刺激的胰島素分泌。FFA作為胞外配體，通過激活胰島β細(xì)胞的GPR40增加葡萄糖刺激的胰島素分泌［3~5］。

長期暴露在高水平FFA下，胰島細(xì)胞長期大量分泌胰島素而出現(xiàn)功能障礙，引起“脂毒性”作用，去除胰島β細(xì)胞中的GPR40可以保護(hù)大鼠不患肥胖誘發(fā)的糖尿病。因此，如果能選擇性地抑制胰島β細(xì)胞膜上的GPR40受體表達(dá)，抑制其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，則可以防止“脂毒性”作用的發(fā)生，進(jìn)而大大降低糖尿病發(fā)生的可能性。本研究擬應(yīng)用反義RNA技術(shù)特異性下調(diào)胰島β細(xì)胞GPR40的表達(dá)，觀察其對胰島 β 細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度（［Ca2+］i）及胰島素分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

成年SD大鼠，8~10周齡，體質(zhì)量250~300 g，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。GPR40反義RNA真核表達(dá)載體 pcDNA3.1（＋）-GPR40（－）質(zhì)粒由美國UniversityofTennesseeZhao博士惠贈；LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，熒光染料探針Fura-2/AM購自Invitrogene公司；膠原酶Ⅴ、軟脂酸、油酸均為美國Sigma公司產(chǎn)品；RPMI-1640購自Gibco公司，胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品，GPR40抗體購自Santa Cruz公司；胰島素放免檢測試劑盒購自中國原子能科學(xué)院；RF-5000型雙波長熒光分光光度計為日本島津制造。1.2 方法

1.2.1 胰島β細(xì)胞的分離純化：成年SD大鼠，腹腔麻醉，剖腹，絲線接扎膽總管入十二指腸處，膽總管內(nèi)插管，逆行灌注0.5 g/L膠原酶Ⅴ10 mL，分離胰腺，38℃水浴振蕩10 min取出，冰浴中撕碎，繼續(xù)38℃水浴振蕩10 min后，D-Hanks液終止消化，重復(fù)1~2次，直到組織完全消化。500 μm篩網(wǎng)過濾消化液，D-Hanks液離心洗滌3遍，沉淀物制成懸液。離心管中，依次加入 250、200、110 g/L Ficoll分離液和胰島懸液，3 000 r/min離心20 min，分層，吸出各界面細(xì)胞，D-Hanks液離心洗滌3遍，置入含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 GPR40反義RNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胰島細(xì)胞：將胰島細(xì)胞以2×105/孔接種于24孔培養(yǎng)板上，按照脂質(zhì)體介導(dǎo)法，取1 μg純化的重組反義RNA表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3.1（＋）-GPR40（－），稀釋于 50 μL 無血清培養(yǎng)液中；加入2.5 μL LipofectamineTM2000脂質(zhì)體至50 μL無血清培養(yǎng)液中，室溫靜置20~30 min；將質(zhì)粒DNA與脂質(zhì)體的復(fù)合體按100 μL/孔加到24孔培養(yǎng)板中之后加入0.5 mL不含血清的培養(yǎng)液，輕輕搖動混勻，置入培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后，移去轉(zhuǎn)染復(fù)合物，加入無血清培養(yǎng)液孵育48 h；同時設(shè)置空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和對照組，每組設(shè)6個復(fù)孔。

1.2.3 免疫熒光染色：將各組胰島細(xì)胞培養(yǎng)于蓋玻片上，37℃下生長36 h后，加入4%多聚甲醛，室溫下固定10 min，加入GPR40單克隆抗體，4℃孵育過夜，用TBS及TBST漂洗后3次，相應(yīng)的二抗室溫下孵育1 h，二抗被相應(yīng)的帶有Alexa F1uor 488546熒光所標(biāo)記。用倒置熒光顯微鏡觀察，未加一抗的陰性對照沒有顯示陽性染色。

1.2.4 Western blot檢測GPR40表達(dá)：收集各組細(xì)胞，RIPA裂解液裂解細(xì)胞，離心收集上清。提取細(xì)胞總蛋白后，BSA法蛋白定量，10%SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜，室溫下5%脫脂奶粉、TBST封閉液封閉1 h，加入特異性GPR40抗體，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗37℃孵育1 h，洗膜3次，ECL顯色系統(tǒng)顯示蛋白條帶，曝光、顯影。用UVP凝膠影象分析儀測定蛋白條帶濃度。

1.2.5 胰島素測定：各組胰島細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，換用含軟脂酸和油酸混合物（軟脂酸∶油酸=2∶1，終濃度為1.0 mmol/L）的RPMI 1640培養(yǎng)液，分別作用胰島細(xì)胞10、30、60 min后，置于濃度為 16.7 mmol/L的高葡萄糖培養(yǎng)液中，37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱孵育2 h，收集培養(yǎng)液，放射免疫法測定胰島素水平。

1.2.6 測定［Ca2+］i：參照文獻(xiàn)［6］的方法，將上述細(xì)胞懸液在37℃預(yù)溫5 min后，加入Fura-2/AM（終濃度為5 μmol/L）37℃恒溫振蕩45 min。負(fù)載后的細(xì)胞以含0.2%牛血清白蛋白的溫Hank液洗滌2次，最后調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×106/mL，測前細(xì)胞先于37℃復(fù)溫2 min，采用熒光分光光度計測定熒光，測試參數(shù)如下：激發(fā)波長340 nm，裂隙寬度3 nm；發(fā)射波長500 nm，裂隙寬度 10 nm。用下面的公式：［Ca2+］i=Kd［（F-Fmin）/（Fmax-F）］（nmol/L）來計算［Ca2+］i濃度。Kd為解離常數(shù)（225 nmol/L），F(xiàn)為測得的熒光強度，F(xiàn)max為加入1%Triton X-100后，測得的最大熒光強度，F(xiàn)min為加入EGTA（10 mmol/L）后測得的最小熒光強度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗結(jié)果均以x±s表示，使用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件，多組樣本均數(shù)間比較用方差分析，組間兩兩比較采用Dunnettt檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光染色結(jié)果

對照組和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組胰島β細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞膜呈現(xiàn)綠色熒光，胰島β細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pcDNA3.1（＋）-GPR40（－）后，綠色熒光明顯減弱（圖1）。

2.2 GPR40反義RNA體外有效抑制胰島細(xì)胞GPR40蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，反義RNA轉(zhuǎn)染組胰島細(xì)胞中GPR40蛋白的表達(dá)水平顯著低于對照組和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而對照組和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組GPR40蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖2），結(jié)果顯示反義RNA轉(zhuǎn)染能夠有效地下調(diào)胰島細(xì)胞中GPR40的表達(dá)。

2.3 GPR40反義RNA對胰島β細(xì)胞［Ca2+］i的影響

當(dāng)加入軟脂酸和油酸混合物時，引起對照組胰島細(xì)胞［Ca2+］i升高分2個時相：即起始的短暫快速相和隨后的持續(xù)相，快速相［Ca2+］i升高呈時間依賴性；同樣軟脂酸和油酸混合物升高空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞［Ca2+］i；而軟脂酸和油酸混合物對反義RNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞［Ca2+］i升高不顯著，在各作用時間點，反義RNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞［Ca2+］i顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表 1）。

2.4 GPR40反義RNA對胰島β細(xì)胞胰島素分泌的影響

軟脂酸和油酸混合物作用對照組胰島細(xì)胞后，隨作用時間增長，胰島素分泌水平明顯增加（P＜0.05），呈時間依賴性；軟脂酸和油酸混合物同樣升高空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組胰島素分泌水平，反義RNA轉(zhuǎn)染組胰島素分泌較其它組受到顯著抑制，在各作用時間點，反義RNA轉(zhuǎn)染組胰島素水平顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表2）。

3 討論

FFA短期作用能調(diào)節(jié)基礎(chǔ)胰島素分泌和葡萄糖刺激的胰島素分泌（glucose stimulated insulin secre－tion，GSIS）。長期FFA水平升高可導(dǎo)致胰島素分泌障礙，甚至胰島β細(xì)胞凋亡，即脂毒性作用，這是形成胰島素抵抗、胰島β細(xì)胞功能減退的重要環(huán)節(jié)，直接參與糖尿病的發(fā)生發(fā)展。

表1 G P R 4 0反義R N A對胰島β細(xì)胞內(nèi)C a2+濃度的影響（n mo l/L，x±s）T a b.1 E f f e c t o f G P R 4 0 a n t i-s e n s e R N Ao n t h e［C a2+］i i n β-c e l l s（n mo l/L，x±s）

中長鏈FFA增強胰腺β細(xì)胞中由葡萄糖刺激產(chǎn)生的胰島素分泌作用與GPR40的活化有關(guān)，已知中長鏈FFA是GPR40的內(nèi)源性配體，一般認(rèn)為有活性的是含有10~16個碳原子的飽和脂肪酸以及含有18~22個碳原子的不飽和脂肪酸。GPR40在胰腺中大量表達(dá)，它作為跨膜受體，可以接受細(xì)胞外FFA的刺激，通過信息轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，使得細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流，放大GSIS［7~9］。本研究顯示，在高濃度葡萄糖和Ca2+存在的環(huán)境下，軟脂酸和油酸混合物可刺激大鼠胰島細(xì)胞膜上的GPR40，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i顯著升高，放大GSIS。FFA作為GPR40的內(nèi)源性配體，通過一種全新的作用機制放大胰島素的分泌。

表2 G P R 4 0反義R N A對胰島β細(xì)胞胰島素分泌的影響（mmo l/L，x±s）T a b.2 E f f e c t o f G P R 4 0 a n t i-s e n s e R N Ao n i n s u l i n s e c r e t i o n i n β-c e l l s（mmo l/L，x±s）

反義RNA技術(shù)是近年發(fā)展起來的新型分子生物學(xué)技術(shù)，它是利用基因重組，構(gòu)建人工表達(dá)載體，使其表達(dá)反義RNA，通過堿基互補與靶RNA配對結(jié)合，特異性封閉基因的手段［10］，在抑制有害基因表達(dá)或失控基因的過度表達(dá)中顯示了良好的應(yīng)用前景。本研究采用反義RNA技術(shù)，結(jié)果表明GPR40反義RNA轉(zhuǎn)染能夠有效地下調(diào)胰島細(xì)胞中GPR40的表達(dá)，并且經(jīng)過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)GPR40的表達(dá)可以顯著抑制細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i升高，同時GPR40反義RNA降低葡萄糖刺激胰島素分泌水平。去除細(xì)胞膜上的GPR40，細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i和胰島素分泌水平將會大大降低，說明軟脂酸和油酸混合物刺激放大的GSIS很大一部分經(jīng)由GPR40實現(xiàn)信息轉(zhuǎn)導(dǎo)。另外有實驗表明，GPR40－/－小鼠能免于肥胖介導(dǎo)的高胰島素血癥、肝脂肪變和糖耐量減退，小鼠胰島β細(xì)胞過度表達(dá)GPR40會損害β細(xì)胞功能［11］。研究結(jié)果表明，對于一些肥胖癥患者，體內(nèi)的高水平的FFA可能會引發(fā)糖尿病的發(fā)生，如果能找到一種高效的GPR40抑制劑，有選擇性地和胰島β細(xì)胞膜上的GPR40受體結(jié)合，抑制其信息轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能，則可以保護(hù)部分患者免受“脂毒性”作用，進(jìn)而大大降低糖尿病發(fā)生的可能性。因此，研究GPR40的高效低毒的小分子拮抗劑，阻斷GPR40的分子有可能用于新型抗糖尿病藥物的開發(fā)，對于防治糖尿病具有非常重要的意義。

綜上所述，F(xiàn)FA能夠通過激活胰島β細(xì)胞的GPR40增加GSIS，用GPR40反義RNA下調(diào)β細(xì)胞GPR40的表達(dá)，導(dǎo)致FFA介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+應(yīng)答及胰島素分泌的顯著抑制，提示GPR40通過介導(dǎo)β細(xì)胞Ca2+信號反應(yīng)參與了FFA刺激的胰島素分泌。

［1］洪旭，馬清，陳海平，等.老年代謝綜合征患者的臨床特點分析［J］.首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2009，30（5）：691-695.

［2］Delarue J，Magnan C.Free fatty acids and insulin resistance［J］.Curr Opin Clin Nutr Metab Care，2007，10（2）：142-148.

［3］Hu H，He LY，Gong Z，et al.A novel class of antagonists for the FFAs receptor GPR40［J］.Biochem Biophys Res Commun，2009，390（3）：557-563.

［4］Oh DY，Lagakos WS.The role of G-protein-coupled receptors in mediating the effect of fatty acids on inflammation and insulin sensitivity［J］.Curr Opin Clin Nutr Metab Care，2011，14（4）：322-327.

［5］Del Guerra S，Bugliani M，D′Aleo V，et al.G-protein-coupled receptor 40 （GPR40）expression and its regulation in human pancreatic islets：the role of type 2 diabetes and fatty acids［J］.Nutr Metab Cardiovasc Dis，2010，20（1）：22-25.

［6］Sch觟fl C，B觟rger J，Lange S，et al.Energetic requirement of carbachol-inducedCa2+signalinginsinglemousebeta-cells［J］.Endocrinology，2000，141（11）：4065-4071.

［7］Wu J，Sun P，Zhang X，et al.Inhibition of GPR40 protects MIN6 β cellsfrompalmitate-inducedERstressandapoptosis［J］.JCellBiochem，2012，113（4）：1152-1158.

［8］Hara T，Hirasawa A，Ichimura A，et al.Free fatty acid receptors FFAR1 and GPR120 as novel therapeutic targets for metabolic disorders［J］.J Pharm Sci，2011，100（9）：3594-3601.

［9］Doshi LS，Brahma MK，Sayyed SG，et al.Acute administration of GPR40 receptor agonist potentiates glucose-stimulated insulin secretion in vivo in the rat［J］.Metabolism，2009，58（3）：333-343.

［10］龔道元，郭婷婷，伏紅霞，等.Survivin反義RNA/HSP70雙基因?qū)?MCF-7 細(xì)胞的影響［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010，30（7）：1587-1589.

［11］Steneberg P，Rubins N，Bartoov-Shifman R，et al.The FFA receptor GPR40 links hyperinsulinemia，hepatic steatosis，and impaired glucose homeostasis in mouse［J］.Cell Metab，2005，1（4）：245-258.