練國(guó)達(dá)， 鄧 輝， 陳茵婷， 曾林涓， 張秋波， 錢(qián)辰琛， 黃開(kāi)紅

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東廣州510120)

胃癌是人類(lèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，死亡病例數(shù)居癌癥導(dǎo)致死亡的第二位［1］。目前認(rèn)為胃癌的發(fā)生、發(fā)展是胃正常黏膜上皮細(xì)胞通過(guò)遺傳及表觀遺傳途徑，在幽門(mén)螺旋桿菌感染、飲食因素、環(huán)境因素等作用下，獲得一系列惡性生物學(xué)性狀的過(guò)程。因此，在分子水平深入探索胃癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制一直是研究的重要方向。

目前的研究已證實(shí)，B淋巴瘤莫洛尼鼠白血病病毒插入?yún)^(qū)1(B lymphoma Moloney murine leukemia virus insertion region 1，Bmi－1)蛋白在人類(lèi)多種惡性腫瘤中高表達(dá)，如頭頸部腫瘤［2］、乳腺癌［3］，其表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展［4］有關(guān)。Bmi－1參與細(xì)胞周期、干細(xì)胞增殖、分化與衰老的調(diào)控［5］，也可以誘導(dǎo)細(xì)胞的早期轉(zhuǎn)化。本課題組前期研究證實(shí)，Bmi－1在胃癌組織中的表達(dá)明顯升高，是判斷胃癌病人預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子之一［6］。Bmi－1與胃癌發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)，但目前尚無(wú)關(guān)于Bmi－1在胃癌發(fā)生發(fā)展具體機(jī)制的系統(tǒng)研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將Bmi－1基因?qū)肴苏Ｎ葛つど掀ぜ?xì)胞GES－1，建立Bmi－1基因過(guò)表達(dá)的體外模型，觀察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞細(xì)胞周期、增殖等方面的變化，為進(jìn)一步研究Bmi－1在胃癌發(fā)生發(fā)展中所起的作用奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料

人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES－1購(gòu)買(mǎi)于北京腫瘤研究所，293FT包裝細(xì)胞購(gòu)于Invitrogen，2株細(xì)胞均應(yīng)用含10%胎牛血清的高糖型DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，在37℃、5%CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pBabe－puro－Bmi－1和空質(zhì)粒pBabe－puro由中山大學(xué)腫瘤防治中心曾木圣教授惠贈(zèng)。鼠抗人Bmi－1單克隆抗體購(gòu)自Millipore，鼠抗人β－actin單克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology。

2 逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝及轉(zhuǎn)染

采用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染PIK包裝質(zhì)粒與pBabe－puro－Bmi－1質(zhì)?；騪Babe－puro質(zhì)粒于293FT包裝細(xì)胞產(chǎn)生病毒，提取病毒上清液;取對(duì)數(shù)期GES－1細(xì)胞接種于6孔板，18～24 h后，細(xì)胞約70%融合時(shí)，將上述病毒上清液加入8 mg/L polybrene(Sigma)，吸干6孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)基，取含polybrene的病毒上清液加入6孔板中，每孔2 mL。6 h后更換含10%胎牛血清的高糖型DMEM培養(yǎng)基。48 h后用含puromycin(0．5 mg/L)的培養(yǎng)基篩選5 d，通過(guò)Western blotting和real－time PCR鑒定穩(wěn)定細(xì)胞株。

3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)(real－time PCR)

以Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度儀測(cè)定RNA純度及濃度，逆轉(zhuǎn)錄，采用Sybrgreen染料法，采用羅氏熒光PCR儀進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)。以β－actin為內(nèi)參照。引物設(shè)計(jì)如下:Bmi－1上游引物5'－GCTGATGCTGCCAATGGCTCTAA －3'，下游引物5'－TCATTCACCTCCTCCTTAGATTTC－3';β－actin 上游引物5'－TGGCACCCAGCACAATGAA －3'，下游引物 5'－CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA－3'。PCR反應(yīng)條件:95℃ 2 min預(yù)變性，95℃ 30 s，60℃ 35 s，40個(gè)循環(huán)。

4 Western blotting分析

將細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至90%時(shí)，用冷PBS洗2次，用含有蛋白酶抑制劑(PMSF)的RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞，采用BCA法測(cè)定總蛋白濃度。取等量總蛋白于10%SDS－PAGE膠電泳。然后將SDS－PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜中，恒流(200 mA)轉(zhuǎn)膜70 min。然后取出PVDF膜，置于5%脫脂奶粉中封閉2 h。加入Ⅰ抗(Bmi－1 1∶1 000，βactin 1∶2 000)，4 ℃過(guò)夜，TBST 洗膜;Ⅱ抗37 ℃搖床孵育1 h，TBST洗膜。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，曝光。條帶灰度分析采用Glyko BandScan 5．0軟件。

5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

常規(guī)消化處理培養(yǎng)細(xì)胞，用70%乙醇4℃固定24 h，加入RNA酶(終濃度為50 mg/L)，37℃反應(yīng)1 h。加入碘化丙啶(PI，濃度為100 mg/L)溶液染色20～30 min后，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)分析。

6 CCK－8法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的過(guò)表達(dá)基因組(GES－1－Bim－1)和空質(zhì)粒組(GES－1－vector)2組細(xì)胞接種在96孔板中，每孔細(xì)胞1×103，每孔總體積100μL，種板后24 h，每天各組分別取7個(gè)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并連續(xù)測(cè)6 d。選6個(gè)孔為實(shí)驗(yàn)組，避光加入CCK－8 10 μL，另一孔設(shè)為對(duì)照，不加CCK－8，然后輕搖5 min，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，2 h后于酶標(biāo)儀檢測(cè)，先以對(duì)照孔調(diào)零，然后檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組波長(zhǎng)為450 nm(A450)處的吸光度。細(xì)胞增殖倍數(shù)=實(shí)驗(yàn)組A450值/A0，A0為實(shí)驗(yàn)組第1 d的A450值。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著差異法(LSD法)。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Real－time PCR和Western blotting檢測(cè)Bmi－1 mRNA和蛋白表達(dá)水平

經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)方法導(dǎo)入質(zhì)粒后，與空白對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞Bmi－1 mRNA表達(dá)量增加(34．5±2．4)倍，而空質(zhì)粒組細(xì)胞 Bmi－1 mRNA 表達(dá)量無(wú)明顯改變，見(jiàn)圖1。Western blotting結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞Bmi－1蛋白表達(dá)水平較空白對(duì)照組及空質(zhì)粒組明顯升高;Western blotting條帶分析表明，與空白對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞Bmi－1蛋白水平較空質(zhì)粒組升高約2倍，而空質(zhì)粒組Bmi－1蛋白水平無(wú)明顯改變，見(jiàn)圖2。

Figure 1．The real－time PCR results for Bmi－1 mRNA expression．ˉx±s．n=3．*P＜0．05 vs A or B．A:GES－1;B:GES－1－vector;C:GES－1－Bmi－1．圖1 Real－time PCR檢測(cè)3組細(xì)胞Bmi－1 mRNA的表達(dá)

Figure 2．Bmi－1 protein expression detected by Western blotting．A:GES－1;B:GES－1－vector;C:GES－1－Bmi－1．ˉx±s．n=3．*P＜0．05 vs A or B．圖2 Western blotting檢測(cè)3組細(xì)胞Bmi－1蛋白的表達(dá)

Real－time PCR和Western blotting結(jié)果表明通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)，能成功將Bmi－1基因?qū)隚ES－1細(xì)胞，并能使其在mRNA和蛋白水平持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)。

2 細(xì)胞周期

過(guò)表達(dá)組細(xì)胞G0/G1期占36.18%±1．80%，空質(zhì)粒組細(xì)胞G0/G1期占42．35%±8．25%。過(guò)表達(dá)組細(xì)胞G2/M期占14．89%±2．76%，空質(zhì)粒組細(xì)胞G2/M期占15．70%±6．50%。過(guò)表達(dá)組細(xì)胞S期占48．94%±0．95%，空質(zhì)粒組細(xì)胞 S 期占 41．96%±1.75%。與空質(zhì)粒組和空白對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而空質(zhì)粒和空白對(duì)照組之間無(wú)顯著差異(P＞0.05)，見(jiàn)圖3。過(guò)表達(dá)Bmi－1基因使GES－1細(xì)胞S期細(xì)胞增多，促進(jìn)GES－1細(xì)胞的增殖。

Figure 3．The cell cycle of GES－1－vector and GES－1－Bmi－1 cells detected by flow cytometry．圖3 空質(zhì)粒組與過(guò)表達(dá)組細(xì)胞周期比較

3 生長(zhǎng)曲線

通過(guò)CCK－8法連續(xù)7 d檢測(cè)轉(zhuǎn)染Bmi－1質(zhì)粒、空質(zhì)粒或未轉(zhuǎn)染的GES－1細(xì)胞的吸光值，繪制生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)組細(xì)胞生長(zhǎng)率明顯高于空質(zhì)粒組(P ＜0．05)和未轉(zhuǎn)染的 GES－1(P ＜0．05)?？召|(zhì)粒組細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的GES－1細(xì)胞之間的生長(zhǎng)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，見(jiàn)圖4。

Figure 4．Growth curves of GES－1，GES－1－vector and GES－1－Bmi－1 cells．ˉx±s．n=3．*P＜0．05 vs GES－1 or GES－1－vector．圖4 CCK－8法檢測(cè)3組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

討 論

胃癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率在人體所有惡性腫瘤中位居第4位，致死率高居第2位，我國(guó)和東南亞大部分地區(qū)屬胃癌高發(fā)地區(qū)［7］。胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟的過(guò)程，涉及抑癌基因突變、原癌基因激活、腫瘤轉(zhuǎn)移基因激活等過(guò)程。原癌基因Bmi－1屬于轉(zhuǎn)錄抑制因子Polycomb(PcG)家族［8］，人類(lèi)Bmi－1基因定位于10號(hào)染色體短臂13區(qū)，編碼一個(gè)含326個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)含有一個(gè)環(huán)指結(jié)構(gòu)(ring finger domain，RF)和保守DNA結(jié)合模序螺旋－轉(zhuǎn)角－螺旋－轉(zhuǎn)角(helixturn－h(huán)elix－turn motif，H－T－H－T)結(jié)構(gòu)域，這2個(gè)區(qū)域在調(diào)控細(xì)胞轉(zhuǎn)化及腫瘤發(fā)生發(fā)展起重要作用［9］。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)多種惡性腫瘤中均存在Bmi－1基因的異常高表達(dá)，同時(shí)，Bmi－1蛋白被認(rèn)為是腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志分子之一［10］。

我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)在胃癌組織中原癌基因Bmi－1不僅在轉(zhuǎn)錄水平，而且在轉(zhuǎn)錄后水平均呈高表達(dá)，胃癌組織陽(yáng)性率與腫瘤大小、臨床分期、侵潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否有關(guān);利用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析，發(fā)現(xiàn)Bmi－1陽(yáng)性表達(dá)為獨(dú)立的胃癌預(yù)后因素;利用生存分析，發(fā)現(xiàn)Bmi－1陰性表達(dá)胃癌患者的生存率高于陽(yáng)性表達(dá)胃癌患者，是判斷胃癌患者預(yù)后的有效指標(biāo)［11－12］。然而到目前為止，Bmi－1 參與胃癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚未闡明。我們通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)，將Bmi－1基因?qū)肴苏Ｎ葛つど掀ぜ?xì)胞株GES－1，運(yùn)用 real－time PCR和 Western blotting方法，證實(shí)在mRNA和蛋白水平Bmi－1基因能持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)，成功構(gòu)建了Bmi－1過(guò)表達(dá)胃黏膜上皮細(xì)胞的體外模型，為進(jìn)一步研究Bmi－1在胃癌中的發(fā)生發(fā)展機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

研究表明，原癌基因Bmi－1編碼的蛋白通過(guò)負(fù)調(diào)控INK4a/ARF位點(diǎn)而影響細(xì)胞增殖和凋亡［13］。INK4a/ARF位點(diǎn)編碼2種增殖抑制相關(guān)蛋白p16INK4a和p19ARF(人類(lèi)為p14ARF)，這兩種蛋白分別通過(guò)腫瘤抑制蛋白pRb和轉(zhuǎn)錄因子p53相關(guān)的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)途徑發(fā)揮作用。pRb在p16INK4a的作用下去磷酸化，從而與轉(zhuǎn)錄因子E2F結(jié)合而阻止細(xì)胞進(jìn)入S期。p19ARF通過(guò)增加鋅指蛋白MDM2與轉(zhuǎn)錄因子p53的結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)衰老和凋亡現(xiàn)象。Bmi－1高表達(dá)通過(guò)抑制p16INK4a和p19ARF的表達(dá)，延長(zhǎng)細(xì)胞增殖期，減少凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)Bmi－1使G0/G1期GES－1細(xì)胞比例減少，S期及G2/M期細(xì)胞比例增加。S期為DNA復(fù)制期，G2/M期為DNA合成后期和細(xì)胞分裂期，細(xì)胞只有跨過(guò)G1/S期的阻止點(diǎn)(restriction point，即R點(diǎn))才能進(jìn)入下一步DNA復(fù)制期，否則進(jìn)入G0期，停止分裂［14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Bmi－1基因過(guò)表達(dá)使處于增殖狀態(tài)的GES－1細(xì)胞比例增高。進(jìn)一步經(jīng)CCK－8法繪制的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，較空白對(duì)照組和空質(zhì)粒組，過(guò)表達(dá)Bmi－1使GES－1的增殖速度明顯增加;且種板后第6 d、第7 d，空白對(duì)照組細(xì)胞和空質(zhì)粒組細(xì)胞增殖處于平臺(tái)期，而過(guò)表達(dá)組細(xì)胞未觀察到平臺(tái)期現(xiàn)象，表明過(guò)表達(dá)可以使人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES－1異常增殖。細(xì)胞異常增殖和凋亡是正常細(xì)胞癌性轉(zhuǎn)變的基本特征。因此，本研究的結(jié)果提示Bmi－1高表達(dá)可能導(dǎo)致正常胃黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，啟動(dòng)胃黏膜上皮的癌變。

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