昝 慧， 黃花榮， 鐘英強(qiáng)△， 吳新環(huán)， 葉小研

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院1消化內(nèi)科，2兒科，廣東 廣州510120)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有多向分化功能［1－2］和免疫調(diào)節(jié)功能。MSCs治療炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)具有一定的實(shí)驗(yàn)和臨床基礎(chǔ)［3－5］。需要進(jìn)行MSCs治療的IBD患者，主要是反復(fù)發(fā)作而且是接受硫唑嘌呤(azathioprine，AZA)治療或依賴者［6］。AZA 對移植的MSCs的增殖與凋亡是否有影響，相關(guān)報(bào)道極少。我們應(yīng)用體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行觀察不同濃度的AZA對來源于大鼠骨髓MSCs的增殖、細(xì)胞周期與凋亡的影響，為臨床應(yīng)用MSCs治療IBD提供最佳微環(huán)境條件。

材料和方法

1 材料與試劑

SD大鼠3周齡，由中山大學(xué)動物中心提供(SPF級)，MSCs取自大鼠骨髓。低糖 DMEM(Gibco)，0.25%含EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid)胰蛋白酶(Giboco)，胎牛血清(杭州四季青公司)，大鼠單克隆抗體:anti－CD29(Biolegend)，anti－CD45(Biolegend)，anti－CD34(Santa Cruz)，anti－ CD44(Santa Cruz)。

2 藥物與分組

硫唑嘌呤(規(guī)格為每片50 mg，上海醫(yī)藥集團(tuán)有限公司)，硫唑嘌呤的濃度設(shè)計(jì)為0、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L和300 mg/L，相應(yīng)分為5組:對照組A 與研究組 B、C、D、E 組。

3 方法

3．1 SD大鼠骨髓MSCs的分離與培養(yǎng) 原代培養(yǎng)采取全骨髓法:SD大鼠頸椎脫臼處死后于75%乙醇中浸泡5 min，移入超凈臺，取出雙下肢股骨及脛骨，眼科剪剪去股骨及股骨骨骺，用無血清的DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，收集骨髓，將獲得的骨髓細(xì)胞懸浮液移入離心管，以1 000 r/min的速度離心10 min，棄上清，用低糖DMEM含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)重懸，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，放置于5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2 d后換液1次，去除未貼壁細(xì)胞，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況及形態(tài)特征，以后每3 d換液1次，當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底80%～90%時，用0．25%含EDTA胰蛋白酶消化，按照1∶2傳代培養(yǎng)。

3．2 MSCs免疫表型的鑒定 檢測第4代MSCs表面標(biāo)志CD29、CD34、CD44和CD45的表達(dá)及表達(dá)細(xì)胞比例。MSCs放置于5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至第4代，細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞密度至1×109/L，每管加入100μL相關(guān)抗體，室溫避光孵育20 min，行流式細(xì)胞儀檢測。

3．3 絕對計(jì)數(shù)法繪制MSCs生長曲線 取第3代細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以5×107/L接種至6孔板培養(yǎng)，每孔1 mL，MSCs放置于5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每天消化并計(jì)數(shù)3個復(fù)孔，連續(xù)測7 d。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，在顯微鏡的低倍鏡下進(jìn)行細(xì)胞直接計(jì)數(shù)，繪制出MSCs生長曲線。

3．4 硫唑嘌呤對SD大鼠MSCs凋亡和細(xì)胞周期的影響 取第3代細(xì)胞，計(jì)數(shù)后以2×108/L接種至6孔板培養(yǎng)，每孔2 mL，MSCs放置于5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。大約第4 d細(xì)胞融合達(dá)70%～80%時換用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)隨機(jī)分為5組，每組3個復(fù)孔，作用24 h、48 h與72 h。細(xì)胞消化后，收集細(xì)胞，以PBS重懸為(1～5)×109/L的細(xì)胞懸液1．0 mL，0．5 mL 立即用于凋亡檢測，0．5 mL 用于細(xì)胞周期檢測。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，SPSS 13．0軟件包處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 SD大鼠骨髓MSCs培養(yǎng)后形態(tài)特點(diǎn)

原代培養(yǎng)2 d后換液，顯微鏡下密布著大小不等的細(xì)胞集落，細(xì)胞形態(tài)較均一，呈放射狀排列，伸出長短不一、粗細(xì)不均的突起，核漿比例大。原代細(xì)胞大約10～12 d后消化傳代，傳代培養(yǎng)的細(xì)胞可在48 h之內(nèi)貼壁，呈長梭形、不規(guī)則形，生長旺盛，形成典型的“漩渦狀”形態(tài)，伴有突起，較原代細(xì)胞扁平，核較大，呈橢圓形，核仁明顯，核漿比例大，6 d可鋪滿瓶底80%，前期細(xì)胞傳代過程中混雜大量其它類型細(xì)胞，通過3次傳代可逐漸純化MSCs，見圖1、2。

2 SD大鼠骨髓MSCs免疫表型

第4代MSCs表面標(biāo)志CD29的陽性率為98.25% ±0.58%，CD34的陽性率為1.11% ±0.34%，CD44的陽性率為98.97% ±0.53%，CD45的陽性率為0.99% ±0.53%，表明本次獲得細(xì)胞為MSCs，見圖3。

Figure 1．Morphological feature of MSCs under phase－contrast microscope(×100)．A:3 d;B:5 d;C:7 d．圖1 在相差顯微鏡下大鼠骨髓MSCs的形態(tài)特點(diǎn)

Figure 2．Morphological feature of MSCs after methyl violet staining(×40)．A:3 d;B:5 d;C:7 d(swirling growth)．圖2 大鼠骨髓MSCs甲基紫染色后的形態(tài)特點(diǎn)

Figure 3．Expression of CD29，CD34，CD44 and CD45 in rat MSCs detected by flow cytometry．圖3 流式細(xì)胞儀檢測大鼠MSCs第4代細(xì)胞表面CD抗原的表達(dá)

3 AZA對大鼠MSCs生長曲線的影響

大鼠MSCs在培養(yǎng)的第2～5 d處于快速的對數(shù)生長期，第6 d進(jìn)入生長平臺期，見圖4A。應(yīng)用AZA作用于大鼠MSCs后，第1 d與2 d無明顯影響，第3 d，與空白對照組比較，50 mg/L與100 mg/L AZA作用下，MSCs增殖雖然受到抑制，但無顯著差異(P＞0.05)，而在200 mg/L與300 mg/L濃度下 MSCs生長受到明顯抑制(P＜0.05)，前者大鼠MSCs的增殖抑制率為64.86% ±0.38%，后者抑制率為67.78% ±0.37%，見圖4B。

4 AZA對大鼠MSCs集落與形態(tài)的影響

200 mg/L和300 mg/L AZA作用于大鼠MSCs 72 h，細(xì)胞集落數(shù)量明顯減少，集落變小，細(xì)胞形態(tài)變窄小，見圖5。

5 AZA對大鼠骨髓MSCs凋亡的影響

各濃度組AZA作用24 h對MSCs的凋亡率均無影響。與空白對照組相比，200 mg/L AZA作用48 h和72 h，大鼠MSCs凋亡率明顯升高(P＜0.05);300 mg/L AZA作用48 h，MSCs的凋亡率明顯升高(P＜0.05)，而作用72 h，MSCs的凋亡率與空白對照組相比明顯降低(P＜0.05)，而MSCs壞死率明顯升高(P＜0.05)，見圖 6、表1。

Figure 4．Effect of AZA on the proliferation of rat MSCs．A:normal growth curves of the fourth generation of rat MSCs;B:growth curves of the fourth generation of rat MSCs treated with different concentrations of AZA．ˉx±s．n=3．圖4 AZA對大鼠骨髓MSCs增殖的影響(絕對計(jì)數(shù)法)

Figure 5．Effect of AZA on the colony formation and morphosis of MSCs(methyl violet staining，×40)．A:50 mg/L AZA for 72 h;B:100 mg/L AZA for 72 h;C:300 mg/L AZA for 72 h．圖5 AZA對大鼠MSCs集落與形態(tài)的影響

Figure 6．Effects of AZA on the apoptosis and necrosis of MSCs(for 72 h)．A:control;B:50 mg/L AZA;C:100 mg/L AZA;D:200 mg/L AZA;E:300 mg/L AZA．圖6 AZA對MSCs凋亡率和壞死率的影響

6 AZA對大鼠骨髓MSCs細(xì)胞周期的影響

在24 h各濃度組AZA對MSCs的細(xì)胞周期均無影響。在48 h，300 mg/L AZA使 MSCs進(jìn)入 G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少(P＜0.05)。在72 h，200 mg/L和300 mg/L濃度AZA使MSCs處于G0/G1期增多，而S期細(xì)胞明顯減少(P＜0.05);300 mg/L濃度下MSCs處于G2－M期的細(xì)胞也明顯減少(P＜0.05)，見圖7、表 1。

Figure 7．Effect of AZA on the cell cycle of MSCs(for 72 h)．A:control;B:50 mg/L AZA;C:100 mg/L AZA;D:200 mg/L AZA;E:300 mg/L AZA．圖7 AZA對MSCs細(xì)胞周期的影響

表1 AZA對MSCs凋亡、壞死和細(xì)胞周期的影響Table 1．Effects of AZA on the apoptosis，necrosis and cell cycle of MSCs(%．xˉ±s．n=3)

討 論

骨髓MSCs對IBD受損的腸道黏膜有修復(fù)作用［7］，而腸道微環(huán)境亦對MSCs的增殖與分化有一定影響［8］，這些微環(huán)境因素包括MSCs與周圍腸黏膜細(xì)胞的相互作用、黏膜所產(chǎn)生的細(xì)胞因子與MSCs的作用、藥物對MSCs的影響等。MSCs經(jīng)靜脈輸注入體內(nèi)后，能定植到受損組織的數(shù)量就很少［9－11］，因此，凡能影響其增殖與分化功能的因素，均可明顯影響MSCs移植治療IBD的效果。

AZA可特異性地抑制核糖核酸合成，抑制T細(xì)胞的免疫反應(yīng)，具有一定抗免疫作用，其抗免疫作用由細(xì)胞內(nèi)的活性代謝產(chǎn)物6－巰基嘌呤所介導(dǎo)［12］。AZA對MSCs增殖與分化影響的研究很少，Lazebnik等［6］對應(yīng)用5－氨基水楊酸、強(qiáng)的松、AZA和甲氨蝶呤治療的44例潰瘍性結(jié)腸炎患者進(jìn)行了MSCs移植治療，觀察了2年，32例治療有效，占72．7%;12例(27．3%)治療無效，但文中并未指明無效者是否與應(yīng)用AZA治療有關(guān)。王莉等［13］觀察了部分細(xì)胞毒藥物(馬利蘭、阿霉素、環(huán)磷酰胺、足葉乙甙、甲氨蝶呤、長春新堿和順鉑)對小鼠肺組織和骨組織間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化的影響，其中對嘌呤代謝有影響的2種細(xì)胞毒性藥物阿霉素和長春新堿對MSCs的增殖有明顯抑制作用，對其分化功能也有一定影響。這提示AZA也可能對骨髓MSCs的增殖有影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，小于100 mg/L濃度的 AZA對MSCs的增殖、細(xì)胞周期與凋亡無顯著影響，而AZA在大于200 mg/L濃度下作用72 h后，MSCs生長受到明顯抑制，抑制率大于66%，凋亡率明顯升高，300 mg/L作用于72 h，MSCs的凋亡率則明顯降低，壞死率明顯升高。這提示一定濃度的AZA，隨著作用時間延長，會促進(jìn)MSCs凋亡，但大劑量時就會直接造成MSCs死亡。同時，大于200 mg/L濃度的AZA，隨著作用時間延長，使MSCs進(jìn)入G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，因而引起MSCs的有絲分裂減少。這提示AZA會引起定植的MSCs過多處于G0/G1期，影響其增殖與分化。

因此，在應(yīng)用MSCs移植治療IBD時，應(yīng)減少AZA的用量或最好不用，否則可能會影響MSCs在受損腸道的增殖，進(jìn)一步可引起細(xì)胞凋亡或死亡，直接影響移植治療的效果。

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