朱淑娟， 孫善全△， 許士葉， 張興業(yè)， 甘勝偉

(1重慶醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究中心，重慶400016;2西安市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安710038)

水分子和離子平衡的調(diào)節(jié)對維持正常腦功能是非常關(guān)鍵的。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，星形膠質(zhì)細胞作為哺乳動物腦內(nèi)最豐富的細胞類型，其調(diào)控作用主要依賴于水通道蛋白(aquaporins，AQPs)、離子通道蛋白及其錨定蛋白三者之間的相互作用而實現(xiàn)的［1］。大量的研究顯示:這些通道蛋白在細胞的表達和極化分布方式被打亂之后，將引起離子和細胞容積的平衡被破壞。另外，血腦屏障中水通道的表達變化也是膠質(zhì)瘤性腦水腫發(fā)生的重要分子機制［2］，但對其增殖、生長機制仍無定論。本實驗從星形膠質(zhì)瘤的惡性程度角度，探討了 AQPs成員中AQP4和AQP8在人不同病理級別星形細胞瘤組織中的表達變化，為初步闡明AQPs在星形細胞瘤增殖生長中的機制提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1 病例及標本采集

星形細胞瘤標本均取自重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科和第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院神經(jīng)外科星形細胞瘤的患者，共55例;以患者腫瘤周圍相對正常腦組織作為對照組。所有標本自術(shù)中取出后，一部分用于病理檢查，另一部分則置于液氮中迅速冷凍后，－80℃保存。經(jīng)病史詢問，所有患者術(shù)前均未接受過免疫治療、放療、化療等治療手段。

2 主要試劑及儀器

單克隆小鼠抗人AQP4和AQP8抗體均購自Abcam;辣根酶標記的兔抗山羊IgG、山羊抗小鼠IgG、DAB顯色試劑盒和Ⅱ抗試劑盒購自中杉金橋公司;β－actin抗體購自武漢博士德公司;SDS聚丙烯酰胺凝膠配置試劑盒、Trizol和AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa。

3 HE及免疫組織化學(xué)染色

將所取相對正常腦組織與各級星形膠質(zhì)瘤組織常規(guī)固定后，行石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度為5μm。脫蠟后HE染色，進行診斷和病理分級。選片，常規(guī)脫蠟，枸櫞酸鹽溶液(pH 6．0)修復(fù)(95℃，40 min)后，按照二步法試劑盒說明書操作，AQP4Ⅰ抗?jié)舛葹?∶500(PBS 配制)，AQP8Ⅰ抗?jié)舛葹?1∶350(PBS配制)，DAB顯色試劑盒顯色，蘇木精復(fù)染細胞核，脫水透明后封片，顯微鏡觀察。采用北航生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(CM－2000B)進行圖像分析，測定免疫組化陽性反應(yīng)細胞的積分吸光度值(IA)。

4 Western blotting檢測

用細胞裂解液(碧云天)提取對照組和各級星形膠質(zhì)瘤組織樣品總蛋白，10%SDS－PAGE凝膠分離蛋白，通過濕轉(zhuǎn)方式將蛋白轉(zhuǎn)至0．45μm孔徑的硝酸纖維膜上，用Ⅰ抗封閉液室溫封閉2 h后，分別加入含 AQP4(1∶1 500)、AQP8(1∶1 000)和 β － actin(1∶5 000)的Ⅰ抗稀釋液(PBS配制)，4℃過夜孵育，PBST洗膜3次，10 min/次，分別滴加山羊抗小鼠IgGⅡ抗(1∶5 000)(PBS配制)稀釋液，37℃孵育2 h，PBST洗膜3次，10 min/次，DAB 試劑盒顯色，用Quantity One軟件轉(zhuǎn)換后BandScan軟件測定條帶灰度值。將AQP4和AQP8分別與β－actin灰度值的比值作為觀察指標，進行統(tǒng)計學(xué)分析。

5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT－PCR)

對照組及不同病理級別星形膠質(zhì)瘤組織各100 mg。按Trizol提取程序(說明書)提取組織總RNA;按AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進行逆轉(zhuǎn)錄后，4℃保存。擴增引物:AQP4上游引物5'－ggaatttctggccatgctta－3'，下游引物 5'－ aagacagacttggcgatgct－3'，擴增片段產(chǎn)物長231 bp。AQP8上游引物5'－tcctgaggagaggttctgga－3'，下游引物 5'－ agagggccctttgtcttctc－3'，擴增產(chǎn)物長159 bp。β－actin上游引物5'－ ctgccgcatcctcttcctc－3'，下游引物 5'－ ctcctgcttgctgatccacat－3'，擴增產(chǎn)物長 398 bp。擴增條件:94℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 20 s，共35個循環(huán)。2%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像儀觀察并照相，用Band Scan 5．0軟件測定條帶灰度值，將 AQP4 mRNA、AQP8 mRNA分別與β－actin mRNA灰度值的比值作為觀察指標，做統(tǒng)計學(xué)分析。

6 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差(ˉx±s)表示，采用SPSS 13．0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，完全隨機設(shè)計，運用兩組間比較的秩和檢驗，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 病理診斷結(jié)果

按照世界衛(wèi)生組織(WHO)對腦細胞瘤分級的診斷標準，結(jié)果顯示:星形細胞瘤Ⅰ級5例，星形細胞瘤Ⅱ級17例，間變性星形細胞瘤(Ⅲ級)19例，膠質(zhì)母細胞瘤(Ⅳ級)14例，見圖1。

Figure 1．Different pathological grades of the astrocytoma samples(HE staining，×400)．A:astrocytoma(WHO gradeⅠ);B:astrocytoma(WHO gradeⅡ);C:anaplastic astrocytoma(WHO gradeⅢ);D:glioblastoma(WHO gradeⅣ)．圖1 星形細胞瘤標本的病理分級

2 AQP4和AQP8的免疫組織化學(xué)結(jié)果

對照組中AQP8主要表達在神經(jīng)元和少量星形細胞細胞內(nèi)，各病理級別星形細胞瘤組織中AQP4和AQP8主要表達在瘤性星形細胞的胞膜和胞質(zhì)內(nèi)。圖像分析結(jié)果顯示，和對照組比較，低級別(Ⅰ～Ⅱ級)腫瘤組織中AQP4表達減少(P＜0．05)，高級別(Ⅲ～Ⅳ級)腫瘤組織中AQP4表達增多(P＜0．05);而低級別腫瘤組織中AQP8的表達明顯增多(P＜0.05)，高級別腫瘤組織中AQP8的表達進一步增強(P＜0.05);低級別(WHOⅠ～Ⅱ級)腫瘤組織之間、高級別(WHOⅢ～Ⅳ級)腫瘤組織之間比較，AQP4和AQP8表達均無明顯差異(P＞0．05)，見圖2、3和表1。

Figure 2．The immunohistochemical staining of AQP4( ×400)．A:astrocytoma(WHO gradeⅠ);B:astrocytoma(WHO gradeⅡ);C:anaplastic astrocytoma(WHO gradeⅢ);D:glioblastoma(WHO gradeⅣ);E:control group．圖2 免疫組化染色顯示AQP4的分布

Figure 3．The immunohistochemical staining of AQP8( ×400)．A:astrocytoma(WHO gradeⅠ);B:astrocytoma(WHO gradeⅡ);C:anaplastic astrocytoma(WHO gradeⅢ);D:glioblastoma(WHO gradeⅣ);E:control group．圖3 免疫組化染色顯示AQP8的分布

表1 對照組和各不同病理級別星形細胞瘤組織中AQP4和AQP8的免疫組化染色Table 1．The IA of AQP4 and AQP8 positive cells in control group and astrocytoma tissues of various pathological grades(IA．ˉx±s．n=9)

3 AQP4和AQP8及其mRNA的含量變化

Western blotting與RT－PCR結(jié)果一致顯示，在對照組及各腫瘤組織中均可看到AQP4和AQP8及其mRNA特定的免疫陽性反應(yīng)產(chǎn)物。條帶分析及統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示，隨腫瘤病理級別的升高，AQP4及其mRNA在低級別腫瘤組織(WHOⅠ～Ⅱ級)中表達減少(P＜0．05)，而在高級別腫瘤組織(WHOⅢ～Ⅳ級)中表達增強，和對照組及低級別腫瘤組織(WHOⅠ～Ⅱ級)比較，P＜0．05。AQP8及其 mRNA在低級別腫瘤組織表達增強(P＜0．05)，在高級別腫瘤組織中表達進一步增強，和對照組及低級別腫瘤組織(WHOⅠ～Ⅱ級)比較，P＜0．05。AQP4和 AQP8在低級別腫瘤組織之間、高級別腫瘤組織之間分別比較，P ＞0．05，見圖4、5。

討 論

1 AQP4在星形細胞瘤中的作用

AQP4是哺乳動物腦內(nèi)主要的水通道蛋白，首次在大鼠肺臟被克隆［3］;AQP4廣泛分布于脊髓、視網(wǎng)膜、內(nèi)耳及骨骼肌等興奮性組織［4－6］中的神經(jīng)支持細胞，如:中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形膠質(zhì)細胞和室管膜細胞，視網(wǎng)膜 Müller膠質(zhì)，內(nèi)耳 Hensen's、Claudius和內(nèi)溝細胞等。在腦內(nèi)，AQP4多集中在毛細血管周圍的膠質(zhì)細胞終足膜、膠質(zhì)界膜、室管膜細胞及室管膜下的星形細胞，主要控制腦內(nèi)水的流動，促使星形膠質(zhì)細胞遷移，改變神經(jīng)元活性。AQP4在星形膠質(zhì)細胞膜的極化分布與血管內(nèi)皮細胞向星形細胞傳遞信號有關(guān)。AQP4不僅是一種通道蛋白，而且還是一種滲透壓感受器，它除了調(diào)節(jié)腦組織的水代謝之外還可能在腦脊液形成和細胞容積變化方面具有重要作用［7］;另外［8］，AQP4 和 Kir4．1 在功能方面相互作用，參與星形膠質(zhì)細胞膜上水的轉(zhuǎn)運和鉀離子的虹吸。

Figure 4．Expression of AQP4(A)and AQP8(B)proteins in human astrocytoma tissues of various pathological grades and control group．1:control group;2:astrocytoma(WHO gradeⅠ);3:astrocytoma(WHO gradeⅡ);4:anaplastic astrocytoma(WHO grade Ⅲ);5:glioblastoma(WHO gradeⅣ)．ˉx±s．n=9．*P＜0．05 vs control;#P＜0．05 vs gradeⅠorⅡ．圖4 星形細胞瘤組織中AQP4和AQP8蛋白的表達

Figure 5．Expression of AQP4(A)and AQP8(B)mRNA．M:marker;1:control group;2:astrocytoma(WHO gradeⅠ);3:astrocytoma(WHO gradeⅡ);4:anaplastic astrocytoma(WHO gradeⅢ);5:glioblastoma(WHO gradeⅣ)．ˉx±s．n=9．*P＜0．05 vs control;#P ＜0．05 vs gradeⅠorⅡ．圖5 星形細胞瘤組織中AQP4和AQP8 mRNA的表達

Saadoun等［9］應(yīng)用免疫組化在5例患者腦腫瘤組織(沒有進行病理分級)中發(fā)現(xiàn)AQP4表達減弱，Warth等［10］又在高級別星形細胞瘤中發(fā)現(xiàn)AQP4高表達;關(guān)于AQP4在不同病理級別的星形細胞瘤組織中的表達情況尚未見報道。本實驗結(jié)果顯示AQP4在低級別星形膠質(zhì)瘤組織中表達減少，而在高級別腫瘤組織中表達增強，與Saadoun和Warth的結(jié)果相符合。AQP4在低級別腫瘤組織中呈現(xiàn)胞內(nèi)及胞膜弱表達，提示低級別星形細胞瘤細胞可能出現(xiàn):(1)AQP4生成減少;(2)AQP4錨定機制損傷，重新分布。AQP4在高級別星形細胞瘤組織中的表達升高可能與腫瘤細胞在快速增殖生長過程中的水轉(zhuǎn)運有關(guān)，然而這些推測尚須進一步通過實驗加以驗證。

2 AQP8在星形細胞瘤中的作用

AQP8作為水通道蛋白家族成員之一，主要分布在消化道上皮細胞(特別是結(jié)腸)、肝及胰腺以及男性和女性生殖系統(tǒng)，但其功能至今仍不甚清楚。人AQP8 cDNA編碼261個氨基酸，其74．1%和大鼠AQP8同源，76%和小鼠同源。AQP8基因含有5個內(nèi)含子，外顯子－內(nèi)含子分界點和其它哺乳動物不同，這可能和種系發(fā)生有關(guān)。人AQP8位于染色體16p12 位點［11］。實驗顯示［12］，在分離純化的大鼠AQP8、人AQP8和小鼠AQP8蛋白中，人AQP8轉(zhuǎn)運水分子和氨，不轉(zhuǎn)運甘油和尿素，其可能在酸堿平衡中發(fā)揮重要作用。Su等［13］利用AQP8基因敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)AQP8缺失可以通過減少卵泡細胞的凋亡而增加成熟卵泡細胞的數(shù)量。在原發(fā)性羊水過多時［14］，羊膜上的AQP8表達增加，而在胎盤卻表達下降，提示AQP8在調(diào)節(jié)羊水體積方面起了重要作用。

肝細胞主要表達AQP8，AQP8起初位于胞內(nèi)囊泡，在雙丁酰 cAMP的誘導(dǎo)下，重新定位至漿膜上［15］。胰高血糖素可誘導(dǎo)劑量依賴性的漿膜AQP8表達上調(diào)，同時胞內(nèi)膜AQP8的下降，表明AQP8從胞內(nèi)囊泡到漿膜的再分布。有文獻報道，正常肝細胞通過AQP依賴的水轉(zhuǎn)運快速對滲透壓變化作出反應(yīng)，從而遭遇凋亡后的細胞死亡結(jié)局;在原代培養(yǎng)的雞肝細胞膜上，30 mmol/L的高糖即可增加AQP8的轉(zhuǎn)位(從胞內(nèi)膜移動到胞漿膜)，并呈濃度依賴性，30 mmol/L甘露醇沒有影響 AQP8 轉(zhuǎn)位［16］;Magdeldin等［17］研究表明，actin相關(guān)蛋白家族可能參與調(diào)節(jié)AQP8分泌小泡遷移并整合到細胞膜的過程。與正常肝細胞相比，肝細胞癌AQP8和AQP9表達明顯下調(diào)［18］，AQP8和AQP9過表達可促進肝細胞的凋亡。上述結(jié)果提示，AQP8轉(zhuǎn)位至胞膜時，可發(fā)揮其水分子快速轉(zhuǎn)運的能力。Calamita等［21］的實驗研究表明:AQP8介導(dǎo)的水轉(zhuǎn)運在線粒體快速腫脹過程中起著非常重要的作用。

盡管水分子進出線粒體的運動對維持其形態(tài)和功能十分重要，然而水分子通過線粒體內(nèi)膜的分子機制仍然不清楚。資料顯示［19］，線粒體決定細胞的生死狀態(tài)。在生理條件下，AQP8和AQP9表達在不同組織細胞的線粒體內(nèi)膜上(包括肝、腎和腦)，調(diào)節(jié)水分子和代謝底物的轉(zhuǎn)運，參與凋亡刺激引起的滲透膨脹。實驗發(fā)現(xiàn)［20］，AQP8介導(dǎo)的線粒體對甲酰胺的轉(zhuǎn)運能力高于對水的轉(zhuǎn)運，表明線粒體內(nèi)膜上AQP8的主要作用是轉(zhuǎn)運氨。凋亡作為保守的細胞過程，最早的形態(tài)學(xué)特征之一是顯著的細胞皺縮(AVD)。于 AVD期間，在 Na+/K+ATP酶抑制之后，Na+、K+被擠出細胞，胞外Na+堆積，細胞內(nèi)外離子濃度發(fā)生變化，從而形成一個滲透梯度，激活A(yù)QPs其它成員(如:AQP4的表達)，介導(dǎo)細胞內(nèi)水分子外流，最終導(dǎo)致細胞皺縮。

Fischer等［22］發(fā)現(xiàn)，AQP8 分布在正常結(jié)腸上皮細胞的腔面，而在結(jié)腸癌組織中，AQP8沒有或極少表達。由此可見，AQP8在細胞內(nèi)、外水電解質(zhì)分布失衡的過程中，具有重要作用，其過表達可促進細胞凋亡，而在腫瘤細胞，AQP8表達下調(diào)，則可維持腫瘤細胞的增殖與生長。然而，本實驗結(jié)果表明，在星形細胞瘤組織中，AQP8大量分布在瘤細胞的胞膜和胞漿內(nèi)，這可能與AQP8的合成增多有關(guān);AQP8的表達和腫瘤病理級別相關(guān):與對照組相比較，AQP8在低級別腫瘤組織中表達上調(diào)，在高級別腫瘤組織中表達進一步增強。推測腫瘤細胞在增殖的過程中，體積增大，含水量增加;水通道蛋白在快速轉(zhuǎn)運水分子的同時，腫瘤細胞可獲取大量營養(yǎng)物質(zhì)和必需的生長因子以備增殖［23］。

由此看來，在不同部位，AQP8的分布具有差異性;在不同病理生理條件下，AQP8的表達同樣具有差異性;在細胞的生長去向過程中，AQP8究竟促使其走向凋亡還是永生化，其作用機制值得進一步研究。

(致謝:感謝重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科孫曉川教授、何朝輝博士和第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院神經(jīng)外科沈光建教授在標本采集方面給予的幫助。)

［1］ Benfenati V，F(xiàn)erroni S．Water transport between CNS compartments:functional and molecular interactions between aquaporins and ion channels［J］．Neuroscience，2010，168(4):926 －940．

［2］ 陳祎招，徐如祥，楊志林，等．膠質(zhì)瘤細胞對血腦屏障水通道表達的影響［J］．中國病理生理雜志，2003，19(7):897－901．

［3］ Hasegawa H，Ma T，Skach W，et al．Molecular cloning of a mercurial－insensitive water channel expressed in selected water－ transporting tissues［J］．JBiol Chem，1994，269(8):5497－5500．

［4］ Li J，Patil RV，Verkman AS．Mildly abnormal retinal function in transgenic mice without Müller cell aquaporin－ 4 water channels［J］．Invest Ophthalmol Vis Sci，2002，43(2):573－579．

［5］ Li J，Verkman AS．Impaired hearing in mice lacking aquaporin － 4 water channels［J］．J Biol Chem，2001，276(33):31233－31237．

［6］ Oshio K，Binder DK，Yang B，et al．Expression of aquaporin water channels in mouse spinal cord［J］．Neuroscience，2004，127(3):685 －693．

［7］ 李燕華，孫善全．低滲液對AQP4蛋白在體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞中的表達變化［J］．中國急救醫(yī)學(xué)，2004，24(2):87－90．

［8］ Nagelhus EA，Mathiisen TM，Ottersen OP．Aquaporin－4 in the central nervous system:cellular and subcellular distribution and coexpression with KIR4．1［J］．Neuroscience，2004，129(4):905 －913．

［9］ Saadoun S，Papadopoulos MC，Krishna S．Water transport becomes uncoupled from K+siphoning in brain contusion，bacterial meningitis，and brain tumours:immunohistochemical case review［J］．J Clin Pathol，2003，56(12):972－975．

［10］ Warth A，Mittelbronn M，Wolburg H．Redistribution of the water channel protein aquaporin－4 and the K+channel protein Kir4．1 differs in low－ and high－grade human brain tumors［J］．Acta Neuropathol，2005，109(4):418－426．

［11］ Koyama N，Ishibashi K，Kuwahara M，et al．Cloning and functional expression of human aquaporin8 cDNA and analysis of its gene［J］．Genomics，1998，54(1):169 －172．

［12］ Liu K，Nagase H，Huang CG，et al．Purification and functional characterization of aquaporin － 8［J］．Biol Cell，2006，98(3):153 －161．

［13］ Su W，Qiao Y，Yi F，et al．Increased female fertility in aquaporin 8 － deficient mice［J］．IUBMB Life，2010，62(11):852－857．

［14］ Zhu X，Jiang S，Hu Y，et al．The expression of aquaporin 8 and aquaporin 9 in fetal membranes and placenta in term pregnancies complicated by idiopathic polyhydramnios［J］．Early Hum Dev，2010，86(10):657 －663．

［15］ Gradilone SA，García F，Huebert RC，et al．Glucagon induces the plasma membrane insertion of functional aquaporin － 8 water channels in isolated rat hepatocytes［J］．Hepatology，2003，37(6):1435 －1441．

［16］ Suh HN，Lee SH，Lee MY，et al．High glucose induced translocation of Aquaporin8 to chicken hepatocyte plasma membrane:involvement of cAMP， PI3K/Akt， PKC，MAPKs，and microtubule［J］．JCell Biochem，2008，103(4):1089－1100．

［17］ Magdeldin S，Li H，Yoshida Y，et al．Comparison of two dimensional electrophoresis mouse colon proteomes before and after knocking out Aquaporin 8［J］．J Proteomics，2010，73(10):2031－2040．

［18］ Jablonski EM，Mattocks MA，Sokolov E，et al．Decreased aquaporin expression leads to increased resistance to apoptosis in hepatocellular carcinoma［J］．Cancer Lett，2007，250(1):36－46．

［19］ Lee WK，Thévenod F．A role for mitochondrial aquaporins in cellular life－and－death decisions? ［J］．Am J Physiol Cell Physiol，2006，291(2):C195 － C202．

［20］ Soria LR，F(xiàn)anelli E，Altamura N，et al．Aquaporin－8－facilitated mitochondrial ammonia transport［J］．Biochem Biophys Res Commun，2010，393(2):217 －221．

［21］ Calamita G，F(xiàn)erri D，Gena P，et al．The inner mitochondrial membrane has aquaporin－8 water channels and is highly permeable to water［J］．J Biol Chem，2005，280(17):17149－17153．

［22］ Fischer H，Stenling R，Rubio C，et al．Differential expression of aquaporin 8 in human colonic epithelial cells and colorectal tumors［J］．BMC Physiol，2001，1:1．

［23］ Jablonski EM，Webb AN，McConnel NA，et al．Plasma membrane aquaporin activity can affect the rate of apoptosis but is inhibited after apoptotic volume decrease［J］．Am JPhysiol Cell Phsiol，2004，286(4):C975－C985．