陳 艾， 童 煜， 毛 萌△

(1四川大學(xué)華西第二醫(yī)院兒科，四川成都610041;2瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科，四川瀘州646000)

自噬(autophagy)是繼壞死和凋亡后發(fā)現(xiàn)的第3種細(xì)胞死亡形式，與疾病的發(fā)生息息相關(guān)，是目前細(xì)胞領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。自噬是指細(xì)胞在自噬相關(guān)基因(autophagy－related gene，Atg)的調(diào)控下利用溶酶體/液泡降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過程，在進(jìn)化過程中有高度的保守性。本文就目前小自噬(microautophagy)的研究近況作一綜述。

1 自噬的背景

真菌中與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的溶酶體相當(dāng)?shù)募?xì)胞器稱為液泡(vacuole)。根據(jù)底物進(jìn)入溶酶體/液泡途徑的不同可將自噬分為3種類型［1－2］:大自噬(macroautophagy)、小自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone－mediated autophagy，CMA)。自噬的主要功能是保證細(xì)胞對(duì)底物的再利用，維持細(xì)胞的相對(duì)穩(wěn)態(tài)［3］。

大自噬即通常所指的自噬，是最主要的自噬形式，其特點(diǎn)是自噬體(autophagosome)的形成［4］。首先，來源不明的游離雙層膜結(jié)構(gòu)包裹胞液或受損的細(xì)胞器，形成自噬體。然后，溶酶體/液泡與自噬體融合形成自噬溶酶體，將其內(nèi)容物降解成氨基酸、游離脂肪酸等為細(xì)胞重建提供原料，并在機(jī)體處于饑餓、營(yíng)養(yǎng)缺乏等條件下提供能量。

小自噬現(xiàn)象最早由de Duve和Wattiaux在1966年發(fā)現(xiàn)，而其概念直到1983年才被明確［5］。酵母中的小自噬研究比較廣泛和深入，而哺乳動(dòng)物細(xì)胞的小自噬研究較少。一般認(rèn)為，小自噬分為非選擇性小自噬(nonselective microautophagy，NSM)和選擇性小自噬(selective microautophagy，SM)［6］，前者是指液泡非特異性吞噬蛋白小微粒或細(xì)胞器成分，表現(xiàn)為液泡膜受底物觸發(fā)后發(fā)生管狀內(nèi)陷，底物從內(nèi)陷處被吸入形成小泡［7］。SM的吞噬對(duì)象是特定的，如線粒體、細(xì)胞核、過氧化物酶體等，表現(xiàn)為哺乳動(dòng)物的溶酶體膜或植物/真菌等生物的液泡膜與被吞噬底物直接融合，溶酶體膜/液泡膜先向外出現(xiàn)臂膀一樣的突起，將特異性底物攬入其中，再逐漸形成多個(gè)內(nèi)陷的小泡，之后小泡完整從膜上的自噬管頂端脫落至膜內(nèi)被降解［3］。小自噬的特點(diǎn)是膜直接形變包裹底物［8］。

CMA為胞漿內(nèi)蛋白底物結(jié)合到分子伴侶后再被轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體腔中，分子伴侶主要為熱休克同源蛋白70(70 kD heat－ shock cognate protein，Hsc70)。Hsc70可識(shí)別5個(gè)氨基酸(賴－苯丙－谷－精－谷酰胺)固定排列的5肽序列(Lys－Phe－Glu－Arg－Gln，KFERQ)，并可與含有此序列的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用。KFERQ是可溶性蛋白，Hsc70與之結(jié)合后，再結(jié)合至溶酶體膜上的溶酶體相關(guān)膜蛋白2(lysosome－associated membrane protein 2，LAMP －2)，轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體內(nèi)降解［9］。

然而最新研究表明，Hsc70－KFERQ－LAMP－2開啟的通路只是分子伴侶介導(dǎo)的一個(gè)類型。Hsc70也可以選擇性地與轉(zhuǎn)運(yùn)所需的內(nèi)體(蛋白質(zhì))分選復(fù)合體(endosomal sorting complex required for transport，ESCRT)結(jié)合，開啟一條類似小自噬的途徑，這條途徑被命名為內(nèi)體小自噬(endosomal microautophagy，eMI)［10］。

2 小自噬概述

2．1 小自噬的相關(guān)基因及信號(hào)通路 Atg在各類自噬中發(fā)揮作用，不再累述。小自噬的特異基因?yàn)椤癆pg/Aut”通路以及兩類Atg7依賴的泛素樣結(jié)合系統(tǒng)(ubiquitin－like conjugation，Ublc)參與了饑餓誘發(fā)的非選擇性小自噬或者葡萄糖誘發(fā)的選擇性小自噬［11］。在第1個(gè)Ublc系統(tǒng)中，Atg8在E1樣酶Atg7和E2樣酶Atg3作用下，經(jīng)過半胱氨酸水解酶的酯化，才能與膜脂質(zhì)的磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)集合。在第2個(gè)Ublc系統(tǒng)，E1樣酶Atg7和E2樣酶Atg10吸引Atg12吸附Atg5，這個(gè)Atg12－Atg5二聚體與Atg16寡聚體化，才能促使Atg8－PE復(fù)合物形成［12］。而Atg8－PE復(fù)合物在小泡形成和融合過程中起關(guān)鍵作用。其它特異性基因見后。

2．2 小自噬的功能 小自噬的溶酶體/液泡直接攝取底物并且與其膜融合并內(nèi)吞的過程彌補(bǔ)了大自噬釋放自噬體時(shí)丟失的大量膜成分。因此，小自噬是大自噬必要的補(bǔ)充，小自噬產(chǎn)生的小泡(vesicles)在功能上相當(dāng)于大自噬的自噬體。小自噬通過小泡內(nèi)吞的膜成分正好補(bǔ)充大自噬以及CMA形成自噬體釋放的膜成分，這種平衡維持了膜的穩(wěn)態(tài)［13］。但是，這些膜成分在3種自噬之間是如何流通和轉(zhuǎn)換的，目前尚不清楚。

3 小自噬的分類

3．1 eMI 最近，Sahu等［10］鑒定出一種由 ESCRT及Hsc70共同參與，將可溶性胞質(zhì)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)體的降解過程。在該研究中，阻斷大自噬過程，可溶性蛋白仍然可以進(jìn)入內(nèi)體;若同時(shí)敲除CMA膜受體LAMP－2A，也不影響內(nèi)體攝取蛋白。通過CMA通路的底物蛋白在攝取之前是完全折疊的，必須先經(jīng)解折疊才能被攝取。而實(shí)驗(yàn)中，溶酶體中的折疊蛋白數(shù)量沒有降低，證明有一條非大自噬也非CMA的自噬通路，于是Sahu等命名這條通路為eMI。

雖然Hsc70沒有任何標(biāo)準(zhǔn)區(qū)域與脂質(zhì)蛋白結(jié)合，但是其C端的AA526－539中有一簇可通過靜電作用與磷脂酸結(jié)合，其它兩簇與疏水的氨基酸區(qū)域結(jié)合，有助于將未解折疊的可溶性脂質(zhì)攝入次級(jí)內(nèi)體后降解。這種結(jié)合是選擇性的，有的底物不經(jīng)Hsc70也能通過eMI途徑被降解［14］。

eMI發(fā)生依賴于胞內(nèi)多泡體(multivesicular bodies，MVBs)的形成，依賴ESCRT I－III系統(tǒng)的激活及其與底物交聯(lián)。ESCRT－I和ESCRT－II是可溶解于細(xì)胞漿的異聚體，ESCRT－III是可溶解于細(xì)胞漿的單體，最終3種復(fù)合物均被募集到溶酶體內(nèi)膜形成不能溶解的矩陣，才能形成MVBs需要的微環(huán)境［15］。

ESCRT－I的亞基包括 VPS23、VPS28和 VPS37等，這些亞基被定植于初級(jí)內(nèi)體膜的VPS27募集在一起，并與膜內(nèi)磷酸化磷脂酰肌醇結(jié)合，此過程中VPS23與VPS27產(chǎn)生交聯(lián)，激發(fā)ESCRT－I與泛素系統(tǒng)聯(lián)合，激活自噬調(diào)控［16］。ESCRT－I與初級(jí)內(nèi)體結(jié)合后才能募集包含VPS22和VPS25的 ESCRT－II形成MVBs通路。MVBs通路開始形成后，已經(jīng)轉(zhuǎn)位在內(nèi)體上的ESCRT－II再吸附胞質(zhì)中的ESCRT－III，至少有6種ESCRT－III亞基存在于酵母中，而在人類至少有10種。3種ESCRT復(fù)合物相互作用，使底物聚集于內(nèi)體膜，同時(shí)誘導(dǎo)后者向腔內(nèi)彎曲出芽，最終脫芽產(chǎn)生胞內(nèi)小囊泡，使底物通過MVBs途徑進(jìn)入內(nèi)體被降解。內(nèi)吞過程執(zhí)行的后期，ESCRT－III必須從ESCRT復(fù)合物上解離以便循環(huán)利用，解離過程由VPS4催化［17］。

以上實(shí)驗(yàn)均提示，小自噬與CMA途徑可能共用一些調(diào)節(jié)因子。在Sahu等的研究基礎(chǔ)上，Santambrogio等［18］總結(jié)了eMI與CMA途徑的主要異同是:eMI途徑的底物為可溶性物質(zhì)，攝入前需為折疊狀，需與磷脂酰絲氨酸結(jié)合，不經(jīng)LAMP－2A識(shí)別，不需GTP供能，最終與次級(jí)內(nèi)體(late endosome)融合后被分解并包裹成外體(exosome)，分泌至溶酶體被降解。

CMA途徑的底物攝入前必須解鏈成單體，在LAMP－2A的引導(dǎo)下，消耗ATP及GTP，最終在溶酶體內(nèi)被降解。其共同點(diǎn)為:2條途徑對(duì)底物均為直接攝取，都需要KFERQ樣序列及Hsc70的識(shí)別，均需消耗ATP酶，見圖1、表1。

Figure 1．The differences between endosomal microautophagy(eMI)and CMA．圖1 內(nèi)體小自噬與分子伴侶小自噬形成的區(qū)別

表1 內(nèi)體小自噬與分子伴侶小自噬的區(qū)別［18］Table 1．The differences between endosomal microautophagy(eMI)and CMA

3．2 非選擇性小自噬 NSM的發(fā)生需要ATP酶以及跨液泡的質(zhì)子梯度;攝取過程需要GTP酶，跨膜電位以及脂肪和膜成分的持續(xù)補(bǔ)充。其調(diào)控因子除了一些自噬相關(guān)蛋白外，還依賴于雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin，TOR)和EGO蛋白復(fù)合體(exit from rapamycin－induced growth)的結(jié)合，后者由Ego1、Gtr2 及 Ego3 組成［19］。

另一類也在NSM中發(fā)生作用，即液泡轉(zhuǎn)運(yùn)伴侶(vacuolar transporter chaperone，VTC)復(fù)合物。當(dāng)饑餓、缺氧等應(yīng)激出現(xiàn)時(shí)，VTC不均一的分布于液泡膜，富集于內(nèi)陷的自噬微管膜上。VTC復(fù)合物包含3個(gè)C端的螺旋狀結(jié)構(gòu):體積較小的VTC1p完全種植于膜內(nèi)，VTC2p、VTC3p/VTC4p復(fù)合物形成一個(gè)較大的N端朝向細(xì)胞質(zhì)。VTC是自噬微管的主要成分，在小泡從微管上剪切下來時(shí)發(fā)揮關(guān)鍵作用。如果VTC變異，自噬微管仍可以形成，但是最終形成的吞噬小泡卻難以被剪切下來［20］。

3．3 酵母研究中發(fā)現(xiàn)的選擇性小自噬

3．3．1 選擇性小自噬的特點(diǎn) 自噬微管的形成是選擇性小自噬區(qū)別于其它自噬的最大特點(diǎn):(1)小自噬開始時(shí)，溶酶體/液泡膜上一些脂質(zhì)從一側(cè)向表面出芽樣突起，進(jìn)而在一些轉(zhuǎn)膜蛋白協(xié)助下，更多的脂質(zhì)或含有脂質(zhì)樣結(jié)構(gòu)的蛋白富集，驅(qū)動(dòng)并參與出芽的過程，此過程需要具有GTP酶活性的Vps1調(diào)控;(2)脂質(zhì)蛋白集落在伸延的同時(shí)收縮卷曲，開始朝胞內(nèi)內(nèi)陷，向內(nèi)彎曲形成類圓形、有一定直徑的小管樣結(jié)構(gòu)，稱為“自噬管”(autophagic tube);(3)同時(shí)，自噬管形成初期出芽處的蛋白扭結(jié)，成為識(shí)別力很強(qiáng)的瓶頸，正是這瓶頸樣結(jié)構(gòu)將自噬管區(qū)別于一般的膜內(nèi)陷;(4)沿著自噬管，細(xì)胞內(nèi)膜蛋白迅速松解后向管的頂端排列，這些同源性蛋白以拓?fù)錁臃绞骄帢?gòu)，在ATP功能下逐漸形成小泡，開始小自噬的選擇性吞噬活動(dòng)［7］。

3．3．2 過氧化物酶體的小自噬(micropexophagy)過氧化物酶體(peroxisome)為真核細(xì)胞的一種細(xì)胞器。同樣，液泡朝過氧化物酶體伸出突起，這種突起被命名為液泡分離膜(vacuolar sequestering membrane，VSM)，經(jīng)常又被間隔成許多小隔膜［21］。在VSM與過氧化物酶體融合時(shí)，帽子形狀的雙層膜結(jié)構(gòu)，稱為過氧化物酶體小自噬特異性膜突起(micropexophagy－ specific membrane apparatus，MIPA)，協(xié)助VSM進(jìn)行吞噬。MIPA是包裹過氧化物酶體的小泡與液泡接觸時(shí)雙層膜處形成的扁平狀小泡，形成于被吞噬小泡的尖端，幫助形成過氧化物酶體自噬體。過氧化物酶體小自噬過程分成3個(gè)階段:(1)液泡與過氧化物酶體接近并排，接收成熟過氧化物酶體發(fā)出的信號(hào);(2)回應(yīng)信號(hào)，液泡出現(xiàn)膜的內(nèi)陷，凹陷處的邊緣形成并伸出手臂一樣的VSM結(jié)構(gòu)，在MIPA協(xié)助下將過氧化物酶體擁入并內(nèi)吞;(3)在吞噬以后，過氧化物酶體被解離產(chǎn)生氨基酸和脂肪以供細(xì)胞循環(huán)再利用。

MIPA的形成與上述過程的實(shí)施需要自噬核心基因的完全調(diào)控，以及過氧化物酶體特異性自噬基因，如 Atg11、Atg20、Atg24、Atg25、Atg26、Atg28 和Atg30 的參與［5］。

3．3．3 核的小自噬 (micronucleophagy，piecemeal microautophagy of the nucleus，PMN) PMN 于 2003年被Roberts等［22］發(fā)現(xiàn)，迄今也僅在酵母研究中被描述。指酵母的部分核膜和核質(zhì)內(nèi)陷進(jìn)入液泡并降解的過程。PMN小泡的包膜有3層，最外層來自于液泡膜，內(nèi)2層來源于核被膜。細(xì)胞核通過核泡連接(nucleus－vacuole junction，NVJ)與酵母的液泡接觸。在氮?dú)饣蚨趸既狈r(shí)，或用雷帕霉素誘導(dǎo)后，NVJ即可產(chǎn)生。

NVJ是一種搭扣樣結(jié)構(gòu)，發(fā)生于液泡膜蛋白Vac8和最外層的核膜蛋白NVJ1之間。在營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)，NVJ1逐漸與脂肪代謝的2個(gè)酶:氧酮結(jié)合蛋白OSH1和輔酶A還原酶TSC13結(jié)合。TSC13為PMN形成所必須的因子之一。OSH1與NVJ1的結(jié)合抑制了絲氨酸與質(zhì)膜的反應(yīng)，從而使NVJ內(nèi)陷形成，釋放裝滿胞核物質(zhì)的小泡到液泡，形成PMN過程［23］。

Dawaliby等［24］研究表明，NVJ在液泡表面形成的屏障在對(duì)蛋白開放的同時(shí)，偶爾會(huì)排斥V－ATP酶，由于PMN過程需要V－ATP酶激活，所以排斥V－ATP酶的屏障只能通過NVJ蛋白家族的成員和其它電化學(xué)成分代謝產(chǎn)生的電位差來釋放小泡，比如OSH1以及TSC13等。所以，NVJ的形成包含2個(gè)獨(dú)立的步驟:NVJ1和VAC8等富集于核泡兩層膜接觸融合的部位;同時(shí)電化學(xué)梯度和酶代謝促使液泡表面形成彌漫的屏障，經(jīng)過如下5個(gè)步驟，最終完成PMN過程，如圖2所示［25］。同樣，PMN也需要核心基因的調(diào)控，如 Atg1～Atg10、Atg12～Atg16、Atg18、Atg22等。同時(shí)，免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PMN的形成需要特異的Atg蛋白，如 Atg11和Atg17。

Figure 2．Prodecure of piecemeal microautophagy of the nucleus．圖2 核的小自噬形成過程［25］

3．3．4 線粒體小自噬(micromitophagy) 線粒體的吞噬主要通過小自噬途徑［6］。當(dāng)氧化應(yīng)激等情況出現(xiàn)時(shí)，線粒體會(huì)出現(xiàn)滲透性轉(zhuǎn)移，此過程中，線粒體出現(xiàn)去極化、膨脹等損傷，最終會(huì)被降解［26］。不同于其它類別的小自噬，經(jīng)過熒光以及電鏡的觀察，線粒體小自噬分為2種類型:一種類型依賴于Uth1，一種部分定植于線粒體外膜的蛋白，液泡接收到線粒體的信號(hào)后慢慢與后者并列，吸引線粒體堆積在其周圍，然后兩者的膜融合產(chǎn)生連接，這種吞噬較精準(zhǔn)，只吞噬線粒體而幾乎不會(huì)包含其它胞質(zhì)成分。第2種發(fā)現(xiàn)于敲除Uth1的野生型酵母，液泡可直接吞噬線粒體以及其周圍的胞質(zhì)碎片［27］。其特異調(diào)控基因?yàn)锳tg32。

3．3．5 哺乳動(dòng)物細(xì)胞的小自噬 Glaumann將分離的大鼠肝細(xì)胞溶酶體與Percoll顆粒一起孵化，發(fā)現(xiàn)Percoll顆粒被溶酶體吞噬，其過程類似酵母中的MIPA。由于溶酶體膜也出現(xiàn)杯子樣突起去包裹Percoll顆粒，哺乳動(dòng)物細(xì)胞的這類小自噬被稱為溶酶體包裹化(lysosomal wrapping mechanism，LWM)。LWM發(fā)生于各種細(xì)胞，如大鼠組織細(xì)胞，經(jīng)輻射后的大鼠腎臟巨噬細(xì)胞等。LWM發(fā)生時(shí)，初級(jí)或次級(jí)溶酶體會(huì)出現(xiàn)變形，由球形拉長(zhǎng)，再伸出手臂一樣的突起。目前認(rèn)為L(zhǎng)WM的特點(diǎn)是:(1)在攝取、吞噬和降解過程中需要消耗ATP;(2)LWM的發(fā)生依靠肌纖維的存在;(3)LWM發(fā)生時(shí)有蛋白合成［28］。

4 小自噬與疾病

目前已有許多研究證實(shí)，小自噬過程出現(xiàn)障礙與許多疾病相關(guān)。如神經(jīng)退行性病變的阿爾茨海默病，以快速進(jìn)行性癡呆、肌陣攣和特征性腦電圖表現(xiàn)為特點(diǎn)的克－雅病(Creutzfeldt－Jakob disease)，以進(jìn)行性慢性小腦性共濟(jì)失調(diào)為表現(xiàn)的格斯特曼－施特勞斯納(Gerstmann－Straussler－Scheinker，GSS)病，膨脹的MVBs在GSS病人的組織中大量存在。多囊腎、心肌衰弱等也與小自噬有關(guān)。心肌糖原沉積病(Pompe病)也和糖原不能被液泡正常攝取有關(guān)［29］。小自噬與各類疾病的關(guān)系引起人們普遍關(guān)注，研究也正逐漸深入。

5 結(jié)語

目前，小自噬的主要功能被認(rèn)為是維持細(xì)胞器的正常大小，保持膜成分在各類型自噬轉(zhuǎn)換流通中量的平衡，以利于營(yíng)養(yǎng)剝奪中細(xì)胞的存活。根據(jù)攝取底物的不同，小自噬被分為許多亞類型，但其發(fā)生過程基本一致，即膜的融合、小泡的形成、底物被溶酶體或液泡內(nèi)吞降解等步驟。目前國(guó)內(nèi)外的研究集中在小自噬的形態(tài)學(xué)方面，在其分子機(jī)制及基因調(diào)控，與大自噬以及分子伴侶自噬之間功能的交互等方面尚需要作進(jìn)一步的研究與總結(jié)。

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