彭林輝， 周 杰， 霍 楓， 蒲淼水， 張 琪， 蘇長青， 錢其軍， 萬云樂

(1南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院肝膽外科，廣東廣州510515;2中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院肝膽外科，廣東廣州510210;3廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院肝膽外科，廣東廣州510010;4中山大學(xué)第三附屬醫(yī)院肝臟病醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510630;5第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院基因－病毒治療實(shí)驗(yàn)室，上海200438)

溶瘤病毒是應(yīng)用基因工程的方法將病毒基因組進(jìn)行改造，使得病毒感染、復(fù)制及溶解細(xì)胞的能力在腫瘤細(xì)胞內(nèi)得到有效增強(qiáng)，而對(duì)正常細(xì)胞影響大為減少;其相應(yīng)的治療理念被稱為病毒治療［1］，是腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。但進(jìn)入臨床發(fā)現(xiàn)，單純病毒治療時(shí)腫瘤的殺傷效率不夠高，如研究較為成功的溶瘤病毒ONYX－015單獨(dú)應(yīng)用治療頭頸部腫瘤有效率不到10%［2］。理論上，在溶瘤腺病毒中插入具有抗癌作用的基因，相應(yīng)的細(xì)胞因子將隨著病毒在腫瘤細(xì)胞中感染、增殖而大量表達(dá)，協(xié)同殺滅腫瘤，這是更有前景的抗癌新策略［3］。我們將具有抗腫瘤作用的小鼠干擾素 γ(mouse interferonγ，mIFN－γ)基因插入溶瘤病毒CNHK300，構(gòu)建了基因病毒治療系統(tǒng)CNHK300－mIFN －γ(CNHK300 －Mγ)［4］。為了明確治療基因插入是否影響溶瘤病毒的抗腫瘤作用和插入基因的表達(dá)情況，本研究采用人肺癌細(xì)胞株A549、人肝癌細(xì)胞株SMMC－7721、人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC－1和正常人成纖維細(xì)胞株BJ，以CNHK300、ONYX－015和攜帶 mIFN－γ的非增殖型腺病毒AdEasy－mIFN －γ(AdEasy－Mγ)作為對(duì)照，進(jìn)行CNHK300－Mγ的抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究。

材料和方法

1 材料來源

人胚胎腎(HEK)293細(xì)胞株購自Microbix Biosystems。細(xì)胞株 BJ、A549和 PANC－1購于 American Type Culture Collection(ATCC)，細(xì)胞株SMMC－7721購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。腺病毒ONYX－015由美國加州大學(xué)Berk AJ教授惠贈(zèng)。重組腺病毒CNHK300、CNHK300－Mγ和AdEasy－Mγ由本實(shí)驗(yàn)室重組并保存。各細(xì)胞株培養(yǎng)液、培養(yǎng)血清及抗生素參照供應(yīng)商推薦，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，0.25%胰酶消化細(xì)胞、傳代。

2 主要方法

2．1 病毒的擴(kuò)增與純化 腺病毒擴(kuò)增采用HEK293細(xì)胞;病毒純化采用常規(guī)氯化銫梯度離心純化法;采用Qbiogene公司的TCID50法測(cè)定病毒滴度。

2．2 病毒增殖實(shí)驗(yàn) 分別收集上述腫瘤及正常細(xì)胞株、計(jì)數(shù)，按5×106cells/well接種6孔板。24 h后當(dāng)腫瘤細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長期，正常細(xì)胞達(dá)到接觸抑制，按感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)=5分別感染 CNHK300－Mγ、CNHK300和 ONYX－015。MOI為病毒數(shù)量與細(xì)胞數(shù)量之比。感染2 h后，將培養(yǎng)液替換成5%血清培養(yǎng)液，放置在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。收集感染0、48 h細(xì)胞凍融液及上清，TCID50法測(cè)定病毒滴度，以0 h病毒滴度為對(duì)照，算出病毒的增殖倍數(shù)。

2．3 細(xì)胞病理效應(yīng)(cytopathic effect，CPE) 將上述腫瘤及正常細(xì)胞按5×104cells/well的密度植入24孔板中，每孔加入1 mL的培養(yǎng)基。24 h后對(duì)細(xì)胞換用無血清培養(yǎng)液，按 MOI=0、0．01、0．1、1、10、100分別加入病毒CNHK300－Mγ、CNHK300和ONYX－015，十字法搖勻，2 h后換用5%血清培養(yǎng)液，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)7 d，每天觀察細(xì)胞的生長情況，7 d后吸掉細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入500 μL結(jié)晶紫染色液(2%結(jié)晶紫溶于20%甲醇)，室溫染色15 min，在純水中充分洗滌掉多余染液后拍照記錄。

2．4 細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn) 接種上述腫瘤及正常細(xì)胞至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(1×104cells/well)，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，按梯度MOI值感染細(xì)胞，分別加入病毒CNHK300－Mγ、CNHK300和ONYX－015，7 d后棄去病毒殘液，四唑鹽比色實(shí)驗(yàn)(MTT assay)檢測(cè)3種病毒對(duì)各種細(xì)胞的殺傷作用。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570 nm波長下測(cè)定光吸收值，參考波長為650 nm。每個(gè)病毒MOI值做8個(gè)復(fù)孔，獨(dú)立重復(fù)3次。

2．5 雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA) 分別收集上述腫瘤及正常細(xì)胞株、計(jì)數(shù)，按5×104cells/well接種24孔板。24 h后當(dāng)腫瘤細(xì)胞達(dá)到對(duì)數(shù)生長期，正常細(xì)胞達(dá)到接觸抑制，分別按MOI=1感染CNHK300－Mγ和AdEasy－Mγ。感染2 h后，將培養(yǎng)液替換成5%血清培養(yǎng)液，放置在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。收集感染3 d、7 d細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用ELISA檢測(cè)其中mIFN－γ的表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17．0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析和相關(guān)分析檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CNHK300－Mγ和CNHK300病毒的擴(kuò)增與純化

與野生型腺病毒比較，重組病毒CNHK300由人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)啟動(dòng)子調(diào)控E1A基因，而重組腺病毒CNHK300－Mγ，在hTERT之前插入了CMV啟動(dòng)子調(diào)控mIFN－γ的基因表達(dá)盒。病毒在HEK293細(xì)胞中反復(fù)擴(kuò)增到需要量，純化后進(jìn)行滴度測(cè)定，CNHK300－Mγ和CNHK300滴度測(cè)定分別為1．0×1012pfu/L和1．6×1012pfu/L。

2 3種病毒在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中的增殖情況

攜帶治療基因的溶瘤腺病毒CNHK300－Mγ在惡性腫瘤細(xì)胞中選擇性增殖，在腫瘤細(xì)胞株中的增殖倍數(shù)是正常細(xì)胞株中的數(shù)百倍(P＜0．01)，見圖1。在腫瘤細(xì)胞株和正常細(xì)胞株增殖差異比較中發(fā)現(xiàn)，A549/BJ、SMMC －7721/BJ和 PANC －1/BJ在CNHK300－Mγ分別為157、622和540，在 CNHK300分別為233、204和262，在 ONYX－015分別為15、1.2和12。由此可見，與 CNHK300相比，mIFN－γ基因插入后，在各種細(xì)胞中的增殖能力均有所下降，但腫瘤細(xì)胞內(nèi)的選擇性增殖能力沒有下降;與ONYX－015相比，CNHK300－Mγ顯示出更為特異的腫瘤細(xì)胞內(nèi)選擇性增殖能力(P＜0．01)。

Figure 1．The replicative folds of CNHK300－Mγ，CNHK300 and ONYX－015 in normal and cancer cell lines．ˉx±s．n=5，＊＊P ＜0．01 vs BJ;#P ＜0.05，##P ＜0．01 vs ONYX －015．圖1 3種病毒在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中48 h的增殖情況

3 3種病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞株和正常細(xì)胞株的殺傷能力

圖2 顯示，CNHK300－Mγ對(duì)腫瘤細(xì)胞株的殺傷能力明顯高于正常細(xì)胞株，在MOI值為1時(shí)均基本殺滅，而正常細(xì)胞株MOI值為100時(shí)才有殺傷力。與ONYX－015相比，CNHK300－Mγ在腫瘤細(xì)胞株的殺傷能力明顯增強(qiáng)，而在正常細(xì)胞株中殺傷力進(jìn)一步減弱。

Figure 2．The killing effect of CNHK300－Mγ，CNHK300 and ONYX －015 in normal and cancer cell lines detected by cytopathic effect assay．1:CNHK300;2:ONYX －015;3:CNHK300－Mγ．圖2 3種病毒在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中的細(xì)胞病理效應(yīng)

4 3種病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的殺傷作用

CNHK300－Mγ和CNHK300均顯示了對(duì)腫瘤細(xì)胞株強(qiáng)大的選擇性殺傷力，腫瘤細(xì)胞株與正常細(xì)胞株之間殺傷力差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)，見圖3。ONYX－015雖然對(duì)腫瘤細(xì)胞株有較強(qiáng)的殺傷作用，但要獲得與CNHK300－Mγ和CNHK300同樣的效果，需要更高的MOI值(P＜0．01)，而對(duì)于正常細(xì)胞株，獲得類似效果，更低的 MOI值就可達(dá)到(P＜0.05)。病毒對(duì)不同細(xì)胞增殖的半數(shù)抑制濃度表明，與ONYX－015相比，CNHK300－Mγ對(duì)正常細(xì)胞株的殺傷力減弱，但對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力明顯提高，特別是在SMMC－7721中，后者是前者的93倍，見表1。

Figure 3．The viability of normal and cancer cell lines infected with the 3 viruses at various MOI detected by MTT assay．ˉx±s．n=24．#P＜0.05，##P＜0.05 vs ONYX－015．圖3 3種病毒在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中的細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)

表1 3種病毒對(duì)不同細(xì)胞增殖的半數(shù)抑制濃度Table 1．The 50%inhibitory concentration(IC50)of the 3 viruses for various cell lines(pfu/cell)

5 mIFN－γ的表達(dá)

AdEasy－Mγ是攜帶mIFN－γ的非增殖型腺病毒，感染惡性腫瘤細(xì)胞后只有少量mIFN－γ的表達(dá)，感染時(shí)間延長，表達(dá)量變化不大，均低于1 500 ng/L;而CNHK300－Mγ感染惡性腫瘤細(xì)胞受后均有大量mIFN－γ的表達(dá)，均高于18 000 ng/L，感染的時(shí)間延長，表達(dá)量均成倍上升，在第3 d時(shí)后者為前者的17～334倍之間，在第7 d時(shí)后者為前者的272～5526倍之間，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)，見圖4。然而正常細(xì)胞株BJ，2種病毒感染后，mIFN－γ的表達(dá)量相似，均不高，感染的時(shí)間延長變化也不大(P＞0.05)。

Figure 4．The expression level of mIFN－γin the supernatants of cells infected with CNHK300－Mγor AdEasy－Mγ．ˉx±s．n=15，＊＊P＜0．01 vs BJ;##P＜0．01 vs AdEasy－Mγ．圖4 2種病毒在不同細(xì)胞株上清液中mIFN－γ的表達(dá)量

討 論

在病毒增殖必需基因的上游插入腫瘤組織特異性啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，可以使病毒只在特定的腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖，而在其它細(xì)胞內(nèi)處于失活狀態(tài)，如甲胎蛋白(alpha－ fetoprotein，AFP)啟動(dòng)子［5］、前列腺癌特異性抗原(prostate － specific antigen，PSA)啟動(dòng)子［6］、缺氧啟動(dòng)子［7］、hTERT啟動(dòng)子等。人端粒酶是一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶，在85%以上的腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，由端粒酶RNA、端粒酶結(jié)合蛋白和hTERT構(gòu)成，其中hTERT的表達(dá)與端粒酶活性高度相關(guān)［8］，是決定其活性的主要因素［9］。CNHK300病毒系統(tǒng)是本室構(gòu)建的用hTERT啟動(dòng)子控制E1A表達(dá)而獲得的溶瘤病毒，具有選擇性裂解端粒酶陽性腫瘤細(xì)胞的能力，與ONYX－015相比，在體外實(shí)驗(yàn)和荷瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均顯示了更強(qiáng)的抗腫瘤效果［10］。

為了優(yōu)化溶瘤病毒的抗癌性，我們進(jìn)一步將CNHK300攜帶上治療基因，期望治療基因在端粒酶陽性的腫瘤細(xì)胞中選擇性地高表達(dá)，增強(qiáng)抗腫瘤效果。IFN－γ是已證實(shí)有多重抗癌作用的細(xì)胞因子，其機(jī)制主要有［11－12］:(1)多重的免疫調(diào)節(jié)作用:調(diào)節(jié)MHCⅠ和MHCⅡ類分子在大多數(shù)免疫細(xì)胞內(nèi)的表達(dá);誘導(dǎo)Th2向Th1分化，減少病毒抗體產(chǎn)生;增加LAK(淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞)的抗腫瘤活性;增強(qiáng)腫瘤壞死因子的抑瘤作用等;(2)直接抑制腫瘤血管生成;此外，它還能影響細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，直接殺傷腫瘤細(xì)胞。目前IFN－γ已應(yīng)用到臨床試驗(yàn)中［13］，但是半衰期短、穩(wěn)定差、活性低、費(fèi)用高，高劑量反復(fù)注射方能取得一定的療效，應(yīng)用明顯受限。

前期研究中我們將含mIFN－γ的外源基因表達(dá)盒插入到溶瘤病毒CNHK300的基因組中，成功地構(gòu)建一種新的基因－病毒治療系統(tǒng)CNHK300－Mγ［4］。本研究發(fā)現(xiàn)mIFN－γ基因插入后，溶瘤病毒在各種細(xì)胞株中的增殖能力和殺傷能力均有所降低，但正常細(xì)胞下降更明顯，與CNHK300相比腫瘤細(xì)胞內(nèi)選擇性增殖能力和對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷能力均無明顯下降，與ONYX－015相比，在腫瘤細(xì)胞中增殖能力和殺傷能力明顯增強(qiáng)，而在正常細(xì)胞中的毒性進(jìn)一步下降。由此可見mIFN－γ基因的插入沒有改變?nèi)芰霾《咀陨硖禺愋詺缒[瘤細(xì)胞的能力。與AdEasy－Mγ相比，CNHK300－Mγ在惡性腫瘤細(xì)胞中能隨著病毒的增殖大量表達(dá)mIFN－γ，并隨時(shí)間相對(duì)延長，表達(dá)量成倍上升，能有效避免傳統(tǒng)基因治療中治療基因表達(dá)率低的主要缺點(diǎn)。

肺癌、肝癌和胰腺癌均是我國常見的重大疾病，一經(jīng)確診大部分為中晚期，治療非常棘手且預(yù)后不理想。國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道端粒酶陽性率在肺癌、肝癌和胰腺癌中為80%～100%，端粒酶活性的表達(dá)和腫瘤侵潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期顯著相關(guān)［9，14－15］。CNHK300 －Mγ 具有類似 CNHK300 的選擇性裂解端粒酶陽性腫瘤細(xì)胞的能力，同時(shí)也能隨著病毒大量增殖高效表達(dá)IFN－γ，具備了基因治療和病毒治療的雙重抗瘤作用，進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)極可能顯示比CNHK300更強(qiáng)的抗瘤效果，擁有較高的惡性腫瘤治療潛力。

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