潘蘇華，劉平平，劉亞鋒，高 青

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院江蘇省中藥藥效與安全評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210046;2.鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南鄭州 450064)

有關(guān)銀杏葉提取物(Ginkgo biloba extract，GBE)對(duì)肝的影響文獻(xiàn)報(bào)道不一［1-2］，為提高銀杏葉制劑的安全用藥，依據(jù)中藥配伍減毒理論用刺梨與GBE配伍研制了復(fù)方銀杏葉制劑(compound Ginkgo biloba，CGB)，并對(duì) CGB 進(jìn)行了化學(xué)性［3］、免疫性［4］肝損傷防護(hù)作用研究，結(jié)果提示CGB有顯著的肝臟保護(hù)效應(yīng)。本研究采用酒精性肝損傷模型，進(jìn)行CGB肝損傷防護(hù)作用與氧化應(yīng)激相關(guān)性研究，探討CGB對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)效應(yīng)及初步機(jī)制。為CGB應(yīng)用于酒精性肝損傷的預(yù)防及輔助治療提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為銀杏葉制劑安全用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SD大鼠，雄性，135只，體質(zhì)量160～220 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供。動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(滬)2007-2005。

1.2 藥品與試劑

GBE購自邳州富偉生化制品有限公司，批號(hào):091116;刺梨汁粉由本室制備，批號(hào):090910。CGB由本室制備，批號(hào):091126，主要成分由GBE與刺梨汁粉按1∶1比例加水配制而成，其有效成分為每100 g含黃酮醇苷≥4.8%、銀杏內(nèi)酯≥1.2%;體積分?jǐn)?shù)為0.56的紅星二鍋頭購自北京紅星股份公司;丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alamine aminotransferase，ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)試劑盒均購自南京建成生物工程公司;氯唑沙宗(批號(hào):017K1385)和氨苯砜(批號(hào):01915CE)對(duì)照品均購自Sigma公司;內(nèi)標(biāo)替硝唑?qū)φ掌酚芍袊幤飞镏破窓z定所提供，批號(hào):130351-200102;甲醇、乙腈均為色譜純;二氯甲烷為分析純;超純水由Millipore超純水系統(tǒng)制備。聯(lián)苯雙酯(bifendate，Bif)，批號(hào):08040103，購自北京協(xié)和藥廠。

1.3 儀器

VITROS 950型全自動(dòng)生化分析儀(美國強(qiáng)生公司);DMLS2型光學(xué)顯微鏡(德國 LEICA公司產(chǎn)品);Biofuge型高速冷凍離心機(jī)(德國Heraeus公司);DY89-Ⅰ型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)(德國IKA公司);JEM-1200EX型透射電鏡(日本電子公司);1100型高效液相色譜儀(包括DAD檢測器和化學(xué)工作站)(美國安捷倫公司)，AL-104型電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.4 動(dòng)物分組給藥

參照文獻(xiàn)［5］方法，大鼠隨機(jī)分為7組:正常對(duì)照組，模型組，GBE 0.8 g·kg-1組，CGB 2.4，0.8 和0.4 g·kg-1組，Bif 0.15 g·kg-1組，正常對(duì)照和模型組每組23只，其余組各15只。除正常組外各組大鼠用白酒-玉米油混懸液 ig造模，玉米油為2 ml·kg-1，白酒劑量第 1 周 18 ml·kg-1，第 2 周22 ml·kg-1，第 3 周起 27 ml·kg-1。正常對(duì)照組大鼠ig等體積生理鹽水;造模同時(shí)分別ig各相應(yīng)藥物，每天1次，持續(xù)10周，10周后取其中7只大鼠測定血清ALT，AST及肝勻漿MDA，SOD和GSH水平，進(jìn)行肝組織病理［6］及肝線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察。

1.5 高效液相色譜法測定氯唑沙宗和氨苯砜的血藥濃度

另取正常對(duì)照組及肝損傷模型組大鼠各8只，分別ig給予CYP2E1探針?biāo)幝冗蛏匙?0 mg·kg-1和CYP3A4探針?biāo)幇北巾?0 mg·kg-1，于給藥前及給藥后5，10，15和30 min，1，2，3，4，6，8，12，16和24 h經(jīng)眼底靜脈叢采血制備血漿，-20℃保存待測。隨后ig給予CGB 25 mg·kg-1，連續(xù)7 d，再按上述方法給予相同劑量的探針?biāo)幭嗤瑫r(shí)間點(diǎn)采血，制備血漿，按文獻(xiàn)［7-8］方法進(jìn)行血樣預(yù)處理，并用高效液相色譜法測定氯唑沙宗和氨苯砜的血藥濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 銀杏葉制劑對(duì)肝損傷大鼠肝功能的影響

由表1以可看出，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清AST和ALT水平顯著升高(P＜0.01);與模型組比較，CGB 2.4 和0.8 g·kg-1組AST 和ALT 顯著下降(P ＜0.05)。

Tab.1 Effect of compound Ginkgo biloba(CGB)on contents of AST and ALT in plasma of alcohol induced liver injuried rats

2.2 CGB對(duì)肝損傷大鼠肝組織MDA含量，SOD和GSH活性的影響

由表2可見，與正常對(duì)照組比較，模型組肝勻漿GSH和SOD明顯降低，MDA顯著升高(P＜0.01)。與模型組比較，CGB 2.4和 0.4 g·kg-1組 MDA 顯著降低(P ＜0.05，P ＜0.01)，CGB 2.4 和 0.8 g·kg-1組SOD和GSH 均顯著升高(P＜0.05，P ＜0.01)。

Tab.2 Effect of CGB on MDA，SOD and GSH activities in liver homogenate of alcohol-induced liver injury rats

2.3 銀杏葉制劑對(duì)肝損傷大鼠肝病理組織學(xué)影響

表3及圖1結(jié)果顯示，正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝索排列整齊，肝竇正常，肝細(xì)胞無明顯病變，核圓，位于細(xì)胞中央，細(xì)胞質(zhì)豐富核結(jié)構(gòu)清晰(圖1A);模型組大鼠肝細(xì)胞存在明顯的肝細(xì)胞脂肪變，部分細(xì)胞呈片狀水腫，大量細(xì)胞存在嗜酸性變，部分匯管區(qū)見炎癥細(xì)胞浸潤和散在壞死灶(圖1B)。與正常對(duì)照組比較，模型組肝細(xì)胞脂肪變性程度有顯著性加重(P ＜0.01)。CGB 0.8 g·kg-1組大鼠肝細(xì)胞存在輕、中度脂肪變性，少部分細(xì)胞存在嗜酸性變，炎癥細(xì)胞浸潤和細(xì)胞壞死情況少見(圖1C，D)。其中CGB 2.4和0.8 g·kg-1組脂肪變程度較模型組有不同程度減輕，且有顯著性差異(P＜0.05)。CGB 0.4 g·kg-1和 GBE 0.8 g·kg-1組大鼠肝細(xì)胞部分細(xì)胞可見片狀水腫和嗜酸性變(圖1D，E)Bif 0.15 g·kg-1輕度脂肪變性，少見炎癥細(xì)胞浸潤和壞死，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.01)。

Tab.3 Effect of CGB on the degree of steatosis in alcoholinduced live injured rats

2.4 銀杏葉制劑對(duì)肝損傷肝線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響

由圖2可見，正常對(duì)照組肝細(xì)胞胞核多呈圓形，胞漿富含線粒體，線粒體嵴清晰可見(圖2A)。模型組大鼠線粒體明顯腫脹、線粒體嵴斷裂、模糊或消失，可見大量大小不等脂滴，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腫脹，變性嚴(yán)重;細(xì)胞核皺縮(圖2B)。CGB 2.4 和0.8 g·kg-1組肝線粒體豐富，內(nèi)部腫脹較輕，嵴損傷減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹減輕(圖2C，D)。GBE 0.8 g·kg-1組有線粒體腫脹，嵴模糊不清(圖2E)，對(duì)線粒體的損傷介于CGB組與模型組之間。

2.5 CGB對(duì)肝損傷大鼠肝組織 CYP2E1和CYP3A4活性的影響

由圖3和表4可見，正常對(duì)照和肝損傷模型大鼠分別單次ig氯唑沙宗和氨苯砜后，模型組大鼠氯唑沙宗和氨苯砜各時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度與正常對(duì)照組比較呈降低趨勢(shì)。模型組大鼠AUC0-24，cmax均較正常對(duì)照組顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)。由此提示酒精刺激可使大鼠體內(nèi)CYP2E1和CYP3A4酶活性升高。

Fig.1 Effect of CGB on liver morphology in alcohol-induced liver injured rats(×100).See Tab.1 for the legend.A:normal control;B:model group;C，D and E:CGB 2.4，0.8 and 0.4 g·kg-1 groups，respectively;F:GBE 0.8 g·kg-1 group;G:Bif 0.15 g·kg-1 group.

Fig.2 Effect of CGB on liver ultrastructure in alcohol-induced liver injured rats.A:normal control group，B:model group，C-D:CGB 2.4 and 0.8 g·kg-1 groups，E:GBE 0.8 g·kg-1 group.

Fig.3 Effect of CGB on blood concentrations of chlorzoxazone(A)and dapsone(DDS)(B)in plasma of rats.Rats in normal control and model gorups were ig given CYP2E1 probe drug chlorzoxazone 50 mg·kg-1 and CYP3A4 probe drugs DDS20 mg·kg-1，respectively，and blood was collected before and after administration 5，10，15，30 min，1，2，3，4，6，8，12，16 and 24 h from the reinal venous，and then rats were ig given CGB 25 mg·kg-1，once a day，for 7 d.Concentrations of chlorzoxazone and DDSwere determined by HPLC.±s，n=8.

Tab.4 Effect of CGB on main pharmacokinetic parameters of chlorzoxazone and DDS

模型組大鼠給CGB后與給藥前相比，血漿中氯唑沙宗、氨苯砜各時(shí)間點(diǎn)血藥濃度呈升高趨勢(shì)。模型組氯唑沙宗和氨苯砜AUC0-24和cmax給予CGB后均較給予CGB前顯著升高(P＜0.05)，且氯唑沙宗t1/2給藥后較給藥前升高(P＜0.05)。其中模型組氯唑沙宗和氨苯砜AUC0-24分別是給予CGB前的1.68和1.44倍。提示CGB可抑制酒精性肝損傷大鼠體內(nèi)CYP2E1和CYP3A4酶活性。

正常對(duì)照組大鼠給予CGB后與給予CGB前相比，大鼠血漿中氯唑沙宗和氨苯砜各時(shí)間點(diǎn)血藥濃度呈降低趨勢(shì)。正常對(duì)照組氯唑沙宗、氨苯砜AUC0-24較給予CGB前明顯降低(P＜0.05)，分別是給予CGB前的0.61和0.73倍;且氯唑沙宗cmax給予CGB后較給予CGB前顯著降低(P＜0.05)。提示CGB可誘導(dǎo)正常大鼠體內(nèi)CYP2E1和CYP3A4酶活性。

3 討論

本研究采用ig給予白酒-玉米油混合制備慢性酒精性肝損傷模型，10周后，模型組大鼠AST和ALT升高、肝細(xì)胞腫脹、脂肪變性，線粒體嵴模糊及嚴(yán)重水腫。SOD和GSH水平明顯下降，MDA含量顯著升高。這與文獻(xiàn)報(bào)道的乙醇經(jīng)肝代謝產(chǎn)生大量自由基，發(fā)生氧化應(yīng)激和生物膜脂質(zhì)過氧化而損傷肝細(xì)胞結(jié)果［9］相一致。CGB 2.4 和 0.8 g·kg-1組可明顯降低血清ALT和AST水平，升高肝勻漿GSH和SOD水平、MDA水平下降，減輕肝細(xì)胞腫脹、脂肪變性及線粒體損傷程度。提示CGB可提高肝清除自由基的能力，減輕乙醇所致的脂質(zhì)過氧化損傷。

有報(bào)道認(rèn)為，在酒精性肝損傷狀態(tài)下，CYP2E1和CYP3A4活性的上調(diào)可致大量自由基產(chǎn)生，加重膜脂質(zhì)過氧化，損傷肝［10-11］。CYP2E1和 CYP3A4是主要在肝表達(dá)的藥物代謝酶的重要亞型，正常情況下，可以促進(jìn)外源性藥物與毒物的代謝，在代謝和解毒以及維持機(jī)體生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要作用［12］;氯唑沙宗主要經(jīng)CYP2E1酶代謝，氨苯砜主要經(jīng)CYP3A4酶代謝，上述兩種藥物常作為酶的探針?biāo)?，而用于考察藥物?duì)CYP2E1和CYP3A4酶活性的作用。本實(shí)驗(yàn)借助氯唑沙宗和氨苯砜在體內(nèi)血藥濃度的變化來反眏藥物對(duì)相應(yīng)酶的影響。乙醇造成肝損傷后，大鼠血漿氯唑沙宗、氨苯砜代謝增強(qiáng)，說明肝損傷過程中CYP2E1和CYP3A4的高誘導(dǎo)參與了氧化損傷過程。模型組大鼠給予CGB后，氯唑沙宗和氨苯砜AUC0-24，cmax均較給藥前顯著升高，其中 AUC0-24分別是給予 CGB前的1.68和1.44 倍(在弱抑制劑的 1.25 ～2 倍范圍內(nèi)［7］)?？梢姡珻GB可抑制模型組大鼠血漿 CYP2E1和CYP3A4酶活性的升高，從而減輕肝氧化應(yīng)激性損傷。

此外，研究發(fā)現(xiàn)正常組大鼠給予CGB后，氯唑沙宗、氨苯砜的AUC0-24較給藥前明顯降低，分別是給藥前的0.61，0.73倍，說明 CGB對(duì)正常大鼠CYP2E1和CYP3A4酶有誘導(dǎo)效應(yīng)，提示CGB與某些經(jīng)肝藥酶代謝的藥物合用時(shí)，可以加速該類藥物的代謝。

研究結(jié)果提示，CGB具有防護(hù)乙醇所致的大鼠肝臟損傷作用，其機(jī)制與氧化應(yīng)激干預(yù)密切相關(guān)。是否刺梨中的SOD、維生素C與銀杏葉提取物中的黃酮醇苷可產(chǎn)生協(xié)同抗氧化，值得進(jìn)一步探討。

［1］Tada Y，Kagota S，Kubota Y，Nejime N，Nakamura K，Kunitomo M，et al.Long-term feeding of Ginkgo biloba extract impairs peripheral circulation and hepatic function in aged spontaneously hypertensive rats［J］.Biol Pharm Bull，2008，31(1):68-72.

［2］Liu H，Shi ZH，Hu W，Liu S，Shu L.Comparison of diateretic effect of Ginkgo biloba extract and colchicine on rats liver fibrosis［J］.Chin J Gastroenterol Hepatol(胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志)，2010，l19(3):234-237.

［3］Pan SH，Wu L，Niu WM.Effects of compound Ginkgo biloba capsule on liver injury in rats［J］.Chin J Integrated Tradit West Med Liver Dis(中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志)，2008，18(6):360-361.

［4］Pan SH，Niu WM，Wu L，Yu RL.Effects of compatibility program of Ginkgo biloba extracts and Rosa roxburghii on experimental liver injury［J］.J Pharm Pract(藥學(xué)實(shí)踐雜志)，2009，27(6):437-438，444.

［5］Gu S，Jiang XL，He L，Wang PL.Establishment of experimental model of chronic alcoholic fatty liver in rats［J］.J Chongqing Med Univ(重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào))，2006，31(1):81-84.

［6］Fatty Liver and Alcoholic Liver Disease Study Group of Chinese Liver Disease Association.Diagnostic criteria of alcoholic liver disease［J］.Chin J Hepatol(中國肝臟病雜志)，2003，11(2):62.

［7］Liu SJ，Liu ZX，Zhou L，Ju WZ，Zhang J，Tan HS.Active ingredients of Tripterygium wilfordii impact on P450 activities using a cocktail method［J］.Chin Pharmacol Bull(中國藥理學(xué)通報(bào))，2011，27(2):276-280.

［8］Chen WK，Ju WZ，Xu LJ，Liu SJ，Tan HS.Effects of Mailuoning injection on rat activities of CYP1A2，CYP2E1 and CYP3A4 using a three-drug cocktail approach［J］.Chin J Clin Pharm Ther(中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué))，2009，14(4):386-390.

［9］Yao P，Song F，Li K，Zhou S，Liu S，Sun X，et al.Ginkgo biloba extract prevents ethanol induced dyslipidemia［J］.Am J Chin Med，2007，35(4):643-652.

［10］Niemel?O， Parkkila S， Juvonen RO， Viitala K，Gelboin HV，Pasanen M.Cytochromes P450 2A6，2E1，and 3A and production of protein-aldehyde adducts in the liver of patients with alcoholic and non-alcoholic liver diseases［J］.J Hepatol，2000，33(6):893-901.

［11］Kang XL，Xue YZ，Wu RS，Liu HL.Metabolic activities of cytochrome P-450 CYP2E1 and cytochrome P-450 CYP3A in hepatic alcohol-injuried rats［J］.Chin J Pharmacol Toxicol(中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志)，2010，24(4):286-290.

［12］Lu Y，Cederbaum AI.CYP2E1 and oxidative liver injury by alcohol［J］.Free Radic Biol Med，2008，44(5):723-738.