李翊衛(wèi)，王曄愷，周吉航，周世權(quán)，曾 芳，劉曉光

(舟山醫(yī)院1.檢驗科，2.細胞分子生物學(xué)實驗室，浙江舟山 316004)

地西他濱(decitabine，DCA)主要用于治療中高危骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes，MDS)。前期研究發(fā)現(xiàn)急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)患者疾病進程和時鐘基因human period3(hPer3)的表達及啟動子甲基化程度存在相關(guān)性，體外AML細胞株HL-60中利用DCA恢復(fù)了hPer3的部分表達并減弱了其啟動子的高甲基化程度［1］。

在國外臨床試驗中，DCA對原發(fā)性AML的療效不佳，單用效果往往不如與某些組蛋白去乙酰化酶抑制劑藥物如丙戊酸(valproic acid，VPA)等聯(lián)合使用［2］。因此，通過觀察DCA和VPA聯(lián)用對原發(fā)性AML細胞株HL-60中hPer3基因的表達調(diào)控，初步探討DCA和VPA聯(lián)用治療原發(fā)性AML的可能機制。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器

對苯二酚、亞硫酸氫鈉、氯仿和氫氧化鈉購自上海晶純試劑有限公司，注射用地西他濱購自西安楊森制藥有限公司，注射用丙戊酸鈉購自賽諾菲-安萬特公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白-碘化丙啶(FITC-AnnexinⅤ/PI)凋亡試劑盒和CD14-FITC均購自美國BD公司，DNA提取純化試劑盒和普通PCR擴增試劑盒購自美國Promega公司，DNA標(biāo)志物購自廣州東盛生物科技有限公司，Trizol購自美國Invitrogen公司，CpG甲基轉(zhuǎn)移酶(CpG methyltransferase，M.SssI)購自北京New England Biolabs(NEB)有限公司，pMD18載體試劑盒和熒光定量PCR試劑盒(Syber GreenⅠ)購自大連TaKaRa生物工程有限公司，MTT試劑盒、小牛血清和1640培養(yǎng)液購自碧云天生物技術(shù)研究所。MS-PCR引物:甲基化甲基化條帶引物:MSF-S:5'-CGGGAGTTTTGGGTATTCGC-3'，MSF-A:5'-CGACCCGACTAACTAAAACG-3'，甲基化產(chǎn)物 182 bp;非甲基化條帶引物:USF-S:5'-TGGGTGGTTGGGTGGGAGTTTTGGGTATTTGT-3'，USF-A:5'-AATCCAA-CACCAACAACCCAACTAACTAAAACA-3'，非 甲 基 化產(chǎn)物207 bp;熒光定量 PCR引物:hPer3-S:5'-ACAAACAGAACCACAAGGCA-3'，hPer3-A:5'-CGTCCATTTGTTGGCATTT-3'，擴增產(chǎn)物94 bp;GAPDH-S:5'-GACCTGACCTGCCGTCTA-3'，GAPDH-A:5'-AGGAGTGGGTGTCGCTGT-3'，擴增產(chǎn)物148 bp;均由上海生工生物工程公司合成。凝膠成像系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司Universal HoodⅡ型，凝膠成像分析軟件為美國Bio-Rad公司Quantity One，普通PCR儀為Roche Mycycle，熒光 PCR 儀為 Roche Lightcycle，CO2培養(yǎng)箱為德國Jouan IG150，酶標(biāo)儀為美國Bio-Rad公司680型，流式細胞儀為美國BD FACSCalibur，獲取軟件為 CellQuest，冰凍離心機為 Eppendorf 5714R，熒光顯微鏡為日本Olympus BX51。

1.2 生物信息學(xué)分析

從MethDB數(shù)據(jù)庫中選取hPer3啟動子中富含CpG島的－465～－269位點區(qū)域利用ABI MethPrimer軟件設(shè)計甲基化引物:MSF-S:(－453～－444)，MSF-A:(－281～－301);非甲基化引物:USF-S:(－465～ －444)，USF-A:(－269～ －301)。

1.3 細胞培養(yǎng)及藥物處理

AML細胞株HL-60購自中科院上海細胞庫。用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)期細胞備用。配制密度為1×108L－1的細胞懸液接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2 ml，置于37℃，5%CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，按照分組分別加入終濃度為 DCA 1.0 和 4.0 μmol·L－1，VPA 2.0 mmol·L－1，DCA 1.0 μmol·L－1+VPA 2.0 mmol·L－1，DCA 4.0 μmol·L－1+VPA 2.0 mmo·L－1，每組設(shè) 6 復(fù)孔，作用48 h后各孔吸出培養(yǎng)液，PBS洗1次，吸棄PBS后進行實驗。

1.4 MTT法檢測細胞存活

1.3中細胞加培養(yǎng)液180μl，實驗終止前加20 μl MTT 5 g·L－1，繼續(xù)培養(yǎng)4h;控干液體，每孔加150 μl DMSO，96孔震蕩板低速混勻10 min。酶標(biāo)儀選擇波長490 nm，測定各組各孔吸光度(A)值。生長抑制率(inhibitory rate，IR)(%)=(1 － A實驗組/A對照組)×100%。另取細胞沉淀涂片，在倒置熒光顯微鏡下觀察各實驗組細胞的變化。

1.5 FITC-AnnexinⅤ/PI標(biāo)記法觀察細胞凋亡

1.3步驟中細胞用預(yù)冷PBS洗滌棄上清，殘渣細胞收集至流式管。每管加5μl AnnexinⅤ-FITC和10 μl PI，避光靜置 15 min，加 300 μl預(yù)冷的PBS，振蕩混勻上機檢測其早期凋亡率。

1.6 實時熒光定量PCR檢測hPer3 mRNA表達

用Trizol提取細胞總RNA，鑒定完整性和純度，取5μg總RNA冰上逆轉(zhuǎn)錄成cDNA進行逆轉(zhuǎn)錄PCR，反應(yīng)體系 25 μl:其中 DNA 模板 2 μl，10 μmol·L－1的hPer3或GAPDH熒光定量PCR引物各1μl，5×PCR緩沖液5μl，加去RNA酶水補至25μl，反應(yīng)條件:95℃ 10 min;95℃ 20 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，30 循環(huán);72℃ 10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)純化后，加入5μl連接緩沖液、4.5 μl純化的目的片段、pMD18-T 載體0.5 μl，低速離心后于16℃連接過夜，將連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后涂氨芐西林平板，挑取單菌落培養(yǎng)過夜，抽提其質(zhì)粒通過PCR鑒定陽性重組子，送上海生工公司測序確證。將重組質(zhì)粒倍比梯度稀釋做為標(biāo)準(zhǔn)品，而樣本cDNA用Syber GreenⅠ熒光染料嵌合法進行檢測，反應(yīng)體系參照試劑說明書，反應(yīng)條件:95℃ 5 min;94℃30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 循環(huán);72℃ 10 min，利用各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別對樣品中的目的基因和內(nèi)參基因進行定量，以hPer3基因拷貝數(shù)與GAPDH基因拷貝數(shù)比值表示細胞中hPer3 mRNA的相對表達量。

1.7 MS-PCR檢測hPer3基因啟動子甲基化

采用苯酚氯仿法抽提白血病細胞株基因組DNA，采用紫外分光光度計測量測定吸光度，確定其純度。吸取4μl基因組DNA至40μl去離子水中，加10 μl氫氧化鈉3 mol·L－1，37℃孵育20 min，加入30 μl的對苯二酚 10 mmol·L－1和 520 μl亞硫酸氫鈉 1.5 mol·L－1，50℃孵育16 h，應(yīng)用 DNA 純化試劑盒純化回收，加入 50 μl氫氧化鈉1 mol·L－1，室溫放置5 min終止修飾，無水乙醇沉淀離心回收，室溫干燥后加入20μl去RNA酶水重懸，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以ddH2O為空白對照，用經(jīng)M.SssⅠ處理后的基因組 DNA為陽性對照。反應(yīng)體系25μl，其中DNA模板2μl，甲基化或非甲基化正反向引物10 μmol·L－1各1 μl，5 × PCR 緩沖液 5 μl，加去離子水補至 25μl。95℃預(yù)變性 15 min;94℃ 50 s，56℃ 40 s，72℃ 60 s，35 個循環(huán);72℃ 5 min，完成擴增反應(yīng)，產(chǎn)物用2%瓊脂糖電泳，凝膠成像儀紫外下觀察結(jié)果。完全和部分甲基化判定為甲基化陽性，無甲基化為甲基化陰性。

1.8 流式細胞儀檢測CD14表達

1.3步驟中細胞用預(yù)冷PBS洗滌棄上清，殘渣細胞收集至流式管。加10μl CD14，放置15 min孵育后PBS洗滌去除未結(jié)合熒光抗體，上機檢測CD14陽性率。CD14陽性率(%)=CD14陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 地西他濱聯(lián)合丙戊酸對HL-60細胞存活的影響

表 1 結(jié)果顯示，VPA 2.0 mmol·L－1+DCA 1.0 mmol·L－1聯(lián)合用藥組生長抑制率高于 DCA 1.0 μmol·L－1組和 VPA 2.0 mmol·L－1組，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01);VPA 2.0+DCA 4.0 聯(lián)合用藥組生長抑制率高于 DCA 4.0 μmol·L－1組和 VPA 2.0 mmol·L－1組，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)。

Tab.1 Synergistic effect of decitabine(DCA)and valproic acid(VPA)on HL-60 survival

2.2 地西他濱聯(lián)合丙戊酸對HL-60細胞凋亡的影響

2.2.1 形態(tài)學(xué)改變

如圖1所示，DCA和VPA處理HL-60細胞后，細胞生長均受到抑制，細胞體積縮小變圓，可見不同形態(tài)的凋亡細胞(圖1B，C，D，E，F(xiàn))。細胞膜皺縮，邊緣濃染致密，膜發(fā)泡成芽，形成凋亡小體脫落等(如箭頭所示)。并且，聯(lián)合用藥組的作用明顯強于單藥組。

2.2.2 AnnexinⅤ/PI雙染觀察細胞凋亡

所有給藥組早期和晚期凋亡率均高于對照組，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);VPA 2.0+DCA 1.0 聯(lián)合用藥組高于 DCA 1.0 μmol·L－1組和VPA 2.0 mmol·L－1組，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01);VPA 2.0+DCA 4.0 聯(lián)合用藥組高于DCA 4.0 μmol·L－1組和 VPA 2.0 mmol·L－1組，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)(圖2和表2)。

Fig.1 Synergistic effect of DCA and VPA on HL-60 morphological changes(×400).See Tab 1 for the legend.A:normal control;B:DCA 1.0 μmol·L －1;C:DCA 4.0 μmol·L －1;D:VPA 2.0 mmol·L －1;E:VPA 2.0+DCA 1.0;F:VPA 2.0+DCA 4.0.Arrow shows apoptosis body.

Fig.2 Synergistic effect of DCA and VPA on HL-60 apoptosis detected by AnnexinⅤ/PI staining.A:normal control;B:DCA 1.0 μmol·L －1;C:DCA 4.0 μmol·L －1;D:VPA 2.0 mmol·L －1;E:VPA 2.0+DCA 1.0;F:VPA 2.0+DCA 4.0.

Tab.2 Synergistic effect of DCA and VPA on HL-60 apoptosis

2.3 地西他濱聯(lián)合丙戊酸鈉對 HL-60細胞中hPer3 mRNA表達的影響

與正常對照組相比，所有給藥組hPer3 mRNA表達均顯著增高(P ＜0.01);VPA 2.0+DCA 1.0 聯(lián)合用藥組顯著高于 DCA 1.0 μmol·L－1組和 VPA 2.0 mmol·L－1組(P ＜0.01);VPA 2.0+DCA 4.0 聯(lián)合用藥組顯著高于 DCA 4.0 μmol·L－1組和 VPA 2.0 mmol·L－1組(P ＜0.01)(表 3)。

Tab.3 Synergistic effect of DCA and VPA on human period3 mRNA(hPer3 mRNA)expression of HL-60 cells

2.4 地西他濱聯(lián)合丙戊酸對HL-60細胞中hPer3啟動子甲基化狀態(tài)的影響

Fig.3 Methylation status of hPer3 promoter in HL-60 cell.See Tab.1 for the legend.M and U represent methylation and unmethylation.1:normal control;2:DCA 1.0 μmol·L －1;3:DCA 4.0 μmol·L －1;4:VPA 2.0 mmol·L －1;5:VPA 2.0+DCA 1.0;6:VPA 2.0+DCA 4.0.

圖3 結(jié)果顯示，HL-60中hPer3為完全甲基化狀態(tài)，DCA 1.0 和4.0 μmol·L－1處理后，高甲基化狀態(tài)均逐漸減弱，出現(xiàn)非甲基化條帶。VPA單獨作用無明顯去甲基化的作用，但VPA與DCA聯(lián)用組去甲基化作用加強。

2.5 地西他濱聯(lián)合丙戊酸對HL-60細胞CD14表達的影響

DCA 1 和4 μmol·L－1顯著增加HL-60 細胞CD14表達率(P ＜0.01)。VPA 2.0+DCA 1.0 聯(lián)合用藥組CD14 表達顯著高于DCA 1.0 μmol·L－1組和VPA 2.0 mmol·L－1組(P ＜0.01);VPA 2.0+DCA 4.0 聯(lián)合用藥組 CD14 表達顯著高于 DCA 4.0 μmol·L－1組和VPA 2.0 mmol·L－1組(P ＜0.01)(表4)。

Tab.4 Synergistic effect of DCA and VPA on CD14 expression of HL-60 cells

3 討論

表觀遺傳學(xué)藥物治療原發(fā)性AML已成為惡性血液疾病化療的研究熱點之一，本研究結(jié)果也顯示，兩種不同機制的表觀遺傳學(xué)藥物DCA和VPA聯(lián)用能增強對HL-60的生長抑制、促凋亡和促分化作用，并且這種作用可能與VPA通過增強DCA對hPer3基因啟動子去甲基化從而促hPer3基因表達有關(guān)。真核細胞基因表達調(diào)控途徑通常有轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控、翻譯水平調(diào)控等，啟動子區(qū)域甲基化屬于轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的一種，如果CpG島的甲基化引起轉(zhuǎn)錄效率降低，那么其轉(zhuǎn)錄效率一般和甲基化程度存在相關(guān)性，如Na等［3］用MS-PCR和逆轉(zhuǎn)錄PCR觀察45例非小細胞肺癌患者GADD45家族基因啟動子甲基化和其基因的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)GADD45G mRNA降低與甲基化存在顯著相關(guān)。Corn等［4］研究發(fā)現(xiàn)，E鈣黏素在白血病細胞株、AML和ALL中啟動子存在高甲基化，并引起E鈣黏素表達沉默。目前多數(shù)研究均表明DCA和VPA聯(lián)用在體外多種腫瘤細胞中均體現(xiàn)出較佳的抗腫瘤活性和恢復(fù)抑癌基因表達的效果，如LU等［5］在U266細胞中聯(lián)用DCA和VPA恢復(fù)抑癌基因rassf1a的表達，Luszczek等［6］發(fā)現(xiàn)DCA與VPA聯(lián)用引起小細胞肺癌DNA損傷。除了直接作用于細胞活性以外，兩類藥聯(lián)用還能間接增強部分腫瘤細胞的對外部處理因素的敏感性，如Cho等［7］觀察到兩類藥聯(lián)用能增強結(jié)腸癌細胞和乳腺癌細胞的輻射敏感性。這些都說明在表觀遺傳學(xué)調(diào)控中，組蛋白去乙?；虳NA甲基化兩種機制可以相互協(xié)調(diào)，共同調(diào)控細胞活性和基因表達。

DCA主要的副作用為骨髓抑制導(dǎo)致血三系降低，進而引起感染風(fēng)險的增加［8］，通常需要口服抗生素加以預(yù)防［9］。研究顯示，DCA雖能促進MDS細胞株向成熟髓系細胞分化，表達CD14和CD11b成熟髓系抗原，但這種促分化作用較低，最高只能使CD14和 CD11b抗原表達率提升到10%左右［10］。本研究顯示，VPA 2.0 mmol·L－1并不能明顯促進HL-60 細胞表達 CD14，但與 DCA 1.0 μmol·L－1聯(lián)用能大幅度促進HL-60表達CD14。CD14為脂多糖(lipoploysaccharide，LPS)受體，存在于單核細胞、巨噬細胞等細胞表面的白細胞分化抗原，識別、結(jié)合LPS，介導(dǎo)LPS性細胞反應(yīng)，在LPS性炎癥反應(yīng)、內(nèi)毒素休克等病理反應(yīng)中起重要作用［11］。本研究顯示，DCA和VPA體外聯(lián)用能促進CD14的表達，提示其增強了體外抗革蘭陰性菌能力。典型的革蘭陰性菌血癥是間歇性和機會性的，雖然這種菌血癥可能不影響健康人，但對化療后的AML患者則可產(chǎn)生嚴(yán)重后果，感染的初發(fā)部位通常在肺部、泌尿生殖道、胃腸道或軟組織，包括患有褥瘡潰瘍的皮膚。如果DCA和VPA在體內(nèi)聯(lián)用也能促白血病細胞分化表達CD14，則有助于增強AML患者的抗革蘭陰性菌能力，但體內(nèi)兩藥聯(lián)用是否也存在類似的效應(yīng)，尚需進一步研究。

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