倪連松，高 倩，顧玲佳

(溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院內分泌科，浙江溫州 325000)

法舒地爾是最早發(fā)現(xiàn)的Rho相關卷曲螺旋形成的蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶(Rho-associated coiledcoil forming protein serine/threonine kinase，ROCK)選擇性抑制劑之一［1］。已有研究表明，在糖尿病動物模型中法舒地爾可以減少尿蛋白、腎小球系膜外基質堆積以及減輕腎小球硬化［2－5］。近年來，越來越多的證據(jù)表明，糖尿病時腎小管間質病變的嚴重程度與蛋白尿排泄量和腎功能的進行性下降密切相關［6］，然而法舒地爾對糖尿病性腎小管間質病變的保護作用尚未見報道。Rho家族蛋白是Ras超家族中小分子G蛋白的成員之一，具有GTP酶活性，故又稱Rho GTP酶，其中對Rho A，Rac1和Cdc42研究得最為廣泛。Rho A分子存在著與GTP結合激活態(tài)和與GDP結合失活態(tài)兩種，在兩種形式相互轉換過程中轉導信號，行使其生理功能。ROCK又稱Rho激酶，是Rho A下游的主要效應因子。近來人們發(fā)現(xiàn)，腎中Rho A/ROCK信號通路具有重要的功能，Rho A/ROCK介導了腎小管細胞、系膜細胞及足細胞的細胞支架的重構;促成了上皮細胞間質轉分化，因而在腎纖維化中起著重要的作用［7］。細胞在某些生理或病理情況下發(fā)生細胞形態(tài)、結構和功能的改變稱為細胞表型轉化，其中上皮細胞在某些條件下轉分化為肌成纖維細胞的現(xiàn)象稱為上皮細胞肌成纖維細胞轉分化(epithelial-myofibroblast transition，EMT)［8］，表現(xiàn)為丟失上皮細胞標志物上皮鈣黏素［9］，以及表達肌成纖維細胞標志物α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)。已有研究顯示，糖尿病性腎病時腎小管上皮細胞可發(fā)生轉分化，并且該轉分化過程在糖尿病性腎病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［10］，尋找新的干預措施逆轉該轉分化過程將是治療糖尿病性腎病的新策略。

為進一步探究法舒地爾對糖尿病性腎病的保護作用機制，根據(jù)前期實驗結果，選擇在安全濃度范圍內的最大濃度20μmol·L－1作為法舒地爾的實驗濃度，探討其對高糖培養(yǎng)腎小管上皮細胞轉分化影響，同時檢測其對轉化生長因子β1(transforming growth factor，TGF-β1)的影響，以探討其作用機制并為其進一步的臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器

人腎小管上皮細胞(HK-2)購自武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCC編號:GDC152。法舒地爾購自天津紅日藥業(yè)股份有限公司產品，批號:091114。DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清為Gibco公司產品。Rho A配體結合沉淀試劑盒購自Millipore公司。鼠抗人Rho A一抗，鼠抗人上皮鈣黏素一抗和鼠抗人α-SMA購自Sant Cruz公司，F(xiàn)ITC標記羊抗鼠IgG抗體購自聯(lián)科生物公司。HRP標記羊抗鼠IgG抗體和碘化丙啶(propidium iodide，PI)購于碧云天公司。激光共聚焦儀器為Olympus公司，酶標儀為Thermo公司，Imaglab凝膠成像系統(tǒng)為Bio-Rad公司，ELISA試劑盒購自上海西唐公司。

1.2 HK-2細胞培養(yǎng)及分組處理

HK-2細胞常規(guī)培養(yǎng)在含10%胎牛血清和葡萄糖5.5 mmol·L－1的 DMEM 培養(yǎng)液中，置 37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，2～3 d換液1次。細胞依次分別加入葡萄糖 5.5 mmol·L－1、葡萄糖 5.5 mmol·L－1+甘露醇 54.5 mmol·L－1、葡萄糖 60 mmol·L－1及葡萄糖 60 mmol·L－1+ 法舒地爾 20 μmol·L－1。

1.3 配體結合沉淀法檢測Rho A活性

HK-2細胞接種在10 cm細胞培養(yǎng)皿中，細胞培養(yǎng)貼壁生長至100%融合后，無血清培養(yǎng)液靜止培養(yǎng)24 h后用葡萄糖60 mmol·L－1的高糖培養(yǎng)液干預，分別于0，0.5，1，3，7，12 和24 h收集細胞，裂解細胞后，收集的細胞，于4℃時，17949×g離心30 min，取50μl上清用于Total-RhoA檢測，余上清加入10μl Rhotekin Rho結合域瓊脂糖 (Rhotekin Rho binding domain agarose，Rhotekin RBD-agarose)，4℃振搖過夜以沉淀GTP-Rho A，變性后取50μl樣本行12%SDS-PAGE電泳，Western印跡法檢測 GTPRhoA的表達，同時取50μl總蛋白樣品檢測總Rho A的表達。Imagelab軟件分析結果，以所測得的各條帶的積分吸光度(integrated absorbance，IA)與相應總Rho A的IA比值作為Rho A活性值。

1.4 免疫熒光細胞化學技術檢測上皮鈣黏素表達

收集培養(yǎng)72 h的各分組細胞爬片，4%多聚甲醛溶液固定和0.1%TritonX-100溶液穿孔細胞后用10%正常羊血清37℃封閉1 h，滴加上皮鈣黏素一抗(1∶100)，4℃孵育過夜，次日清洗后滴加FITC標記的二抗(1∶200)避光37℃孵育30 min，后行PI染色30 min，清洗后用抗熒光淬滅封片劑封片，立即用激光共聚焦顯微鏡觀察并拍片，每組隨機選3個視野用圖像分析軟件進行分析，IA與視野總面積的比值表示上皮鈣黏素表達量。

1.5 Western印跡法檢測α-SMA的表達

1.5.1 細胞培養(yǎng)及分組

HK-2細胞接種于10 cm細胞培養(yǎng)皿中，細胞培養(yǎng)貼壁生長至70%融合后，更換為無血清培養(yǎng)液靜止24 h，按實驗分組換為不同的培養(yǎng)液，分別于72 h提取細胞蛋白。

1.5.2 細胞總蛋白提取與定量

收集細胞后，冰上裂解細胞30 min，收集裂解液5 min，4℃，17 949×g離心后收集上清用BCA蛋白濃度測定法測定蛋白濃度，操作按說明書。5×上樣緩沖液變性蛋白后－20℃保存。

1.5.3 細胞內α-SMA蛋白量的檢測

取60μg總蛋白上樣，用10%濃度的SDS-PAGE膠進行電泳。恒流將蛋白轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫搖床封閉2 h，分別加入 α-SMA(1∶200)，GAPDH(1∶1000)一抗，4℃過夜。清洗后分別加入相應的HRP標記的Ig G(1∶1000)二抗，室溫搖床孵育1 h，洗膜后分別取等量ECL試劑盒溶液A和B液混合后加于PVDF膜，避光反應1 min，Molecular Imager ChemiDocTMXRS和成像系統(tǒng)自動曝光掃描并用Imagelab軟件分析結果，以所測得的各條帶的A與內參照GAPDH A的比值作為α-SMA的半定量值。

1.6 ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清TGF-β1含量

收集培養(yǎng)24 h和48 h細胞上清液4℃，4142×g離心3 min后ELISA法檢測TGF-β1，具體操作按試劑盒說明書。收集細胞冰上裂解后離心，收集上清用BCA蛋白濃度測定法測定蛋白濃度，操作按說明書，以矯正ELISA結果。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 高糖對HK-2細胞Rho A活性的影響

圖1結果顯示，與未刺激前(0 min)比較，高糖60 mmol·L－1培養(yǎng)3 ～24 h后 HK-2 細胞 Rho A 活性明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，其中3 h為最高，是為刺激前的4.5倍，提示在一定時間范圍內，高糖可以刺激HK-2細胞Rho A分子活化。

2.2 法舒地爾對高糖培養(yǎng)HK-2細胞上皮鈣黏素表達的影響

如表1和圖2結果顯示，與正常對照組比較，高糖60 mmol·L－1培養(yǎng)72 h后HK-2細胞內上皮鈣黏素蛋白表達明顯減少(P＜0.01)，高張組區(qū)別不具統(tǒng)計學意義，提示高糖可成功誘導HK-2細胞表型轉換，高張并不能引起HK-2細胞表型轉換。與高糖組比較，法舒地爾20μmol·L－1同步干預72 h后上皮鈣黏素蛋白表達量增多，但仍低于正常對照組，提示法舒地爾20μmol·L－1不能完全抑制高糖誘導的HK-2細胞轉分化。

Fig.1 Effect of high glucose on Rho A activity of HK-2 cells.B was the semiquantitative result of A.Lanes 1－7 were HK-2 cells cultivated with glucose60 mmol·L－1 for 0，0.5，1 ，3 ，7 ，12 and 24 h，respectively.±s，n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with 0 min group.

Tab.1 Effect of fasudil on E-cadherin expression of HK-2 cells cultivated in high glucose

Fig.2 Effect of fasudil on E-cadherin expression of HK-2 cells cultivated in high glucose detected by confocal laser scanning microscopy(PI×400).See Tab 1 for the treatment.A:normal control group;B:high tension group;C:high glucose group;D:high glucose+fasudil group.

2.3 法舒地爾對高糖培養(yǎng)HK-2細胞α-SMA表達的影響

如圖3結果顯示，與正常對照組比較，高糖60 mmol·L－1培養(yǎng)HK-2 細胞72 h 后，細胞 α-SMA 蛋白表達量明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，高張組差異不具有統(tǒng)計學意義，提示是高糖可以誘導HK-2細胞向肌成纖維細胞轉化，而高張培養(yǎng)不能誘導其轉化。與高糖組比較，法舒地爾20μmol·L－1同步干預72 h后HK-2細胞α-SMA表達量明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，提示高糖誘導HK-2細胞向肌成纖維細胞轉化作用能被法舒地爾抑制。

Fig.3 Effect of fasudil on α-smooth muscle actin(α-SMA)expression of HK-2 cells cultivated in high glucose detected by Western blotting.See Tab.1 for the treatment.B was the semiquantitative result of A.1－4 were normal control group，high tension group，high glucose group and high glucose+fasudil group，respectively.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group;#P ＜0.05，compared with high glucose group.

2.4 法舒地爾對高糖培養(yǎng)HK-2細胞TGF-β1分泌的影響

表2結果顯示，與正常對照組比較，高糖60 mmol·L－1培養(yǎng)24或48 h可增加HK-2細胞上清液中TGF-β1的合成，且隨著時間的延長而增加(P ＜0.01)。法舒地爾20 μmol·L－1同步干預24 或48 h后，對高糖刺激HK-2細胞TGF-β1的合成作用具有明顯抑制作用，但法舒地爾同步干預24 h不能完全抑制高糖的刺激作用。

Tab.2 Effect of fasudil on transforming growth factor-β1(TGF-β1)secretion of HK-2 cells cultivated in high glucose

3 討論

本實驗發(fā)現(xiàn)，HK-2細胞在高糖60 mmol·L－1條件下培養(yǎng)72 h后，上皮鈣黏素表達下降，α-SMA表達升高，發(fā)生EMT，與 Zhou等［11］的研究結果一致。本實驗首次發(fā)現(xiàn)高糖60 mmol·L－1能激活HK-2細胞Rho A活性，表現(xiàn)為GTP-Rho A與總Rho A的比值增加，進一步補充了Massey等［12］關于糖尿病實驗動物腎皮質存在Rho A的活化的研究結果，為研究法舒地爾對高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細胞轉分化的作用提供了理論依據(jù)。

本研究結果發(fā)現(xiàn)，高糖 60 mmol·L－1誘導的HK-2細胞轉分化，能部分被法舒地爾抑制，表現(xiàn)為經法舒地爾同步干預后，細胞上皮鈣黏素表達增加，α-SMA表達下降，證實了法舒地爾對糖尿病性腎小管間質病變的保護作用，也進一步闡明了法舒地爾的糖尿病性腎病保護作用機制，但是本研究還發(fā)現(xiàn)，法舒地爾不能完全抑制EMT，法舒地爾干預組與正常糖濃度培養(yǎng)組表型標志物表達量存在的差異具有統(tǒng)計學意義，提示高糖可能還通過Rho A/ROCK通路以外的信號通路誘導EMT。Lee等［13］就曾報道PI3K/Akt在高糖誘導的腎小管上皮細胞EMT中起重要作用。

TGF-β1是公認致纖維化的細胞因子，在糖尿病性腎病的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。有研究顯示TGF-β1可以導致腎小管上皮細胞發(fā)生 EMT［14］。本研究顯示HK-2細胞在高糖60 mmol·L－1培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24和48 h，HK-2細胞上清液中TGF-β1明顯增多，且隨著刺激時間的延長而增多，因此高糖刺激HK-2細胞發(fā)生EMT可能與TGF-β1介導有關。本研究發(fā)現(xiàn)，經法舒地爾同步干預后，HK-2細胞上清中的TGF-β1明顯減少，表明法舒地爾抑制腎小管上皮轉分化可能部分是通過抑制TGF-β1的產生而介導的。法舒地爾對正常糖濃度培養(yǎng)的HK-2細胞TGF-β1分泌的影響尚有待研究。

總之，本研究結果顯示，高糖能誘導培養(yǎng)HK-2細胞發(fā)生EMT，并能激活Rho A分子;Rho A/ROCK通路抑制劑法舒地爾能明顯抑制該轉分化過程;法舒地爾抑制腎小管上皮轉分化的作用可能部分是通過抑制TGF-β1生成而介導的。

［1］Liao JK，Seto M，Noma K.Rho kinase(ROCK)inhibitors［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2007，50(1):17-24.

［2］Gojo A，Utsunomiya K，Taniguchi K，Yokota T，Ishizawa S，Kanazawa Y，et al.The Rho-kinase inhibitor，fasudil，attenuates diabetic nephropathy in streptozotocin-induced diabetic rats［J］.Eur J Pharmacol，2007，568(1-3):242-247.

［3］Peng F，Wu D，Gao B，Ingram AJ，Zhang B，Chorneyko K，et al.RhoA/Rho-kinase contribute to the pathogenesis of diabetic renal disease［J］.Diabetes，2008，57(6):1683-1692.

［4］Kikuchi Y， Yamada M， Imakiire T， Kushiyama T，Higashi K，Hyodo N，et al.A Rho-kinase inhibitor，fasudil，prevents development of diabetes and nephropathy in insulin-resistant diabetic rats［J］.J Endocrinol，2007，192(3):595-603.

［5］Kolavennu V，Zeng L，Peng H，Wang Y，Danesh FR.Targeting of RhoA/ROCK signaling ameliorates progression of diabetic nephropathy independent of glucose control［J］.Diabetes，2008，57(3):714-723.

［6］Gilbert RE，Cooper ME.The tubulointerstitium in progressive diabetic kidney disease:more than an aftermath of glomerular injury［J］?Kidney Int，1999，56(5):1627-1637.

［7］Hayashi K，Wakino S，Kanda T，Homma K，Sugano N，Saruta T.Molecular mechanisms and therapeutic strategies of chronic renal injury:role of rho-kinase in the development of renal injury［J］.J Pharmacol Sci，2006，100(1):29-33.

［8］Yang J，Liu Y.Blockage of tubular epithelial to myofibroblast transition by hepatocyte growth factor prevents renal interstitial fibrosis［J］.J Am Soc Nephrol，2002，13(1):96-107.

［9］Cheng HX，Yang XP，Zhao J.E-cadherin and renal interstitial fibrosis［J］.J Clin Exp Med(臨床和實驗醫(yī)學雜志)，2010，15(9):1184-1187.

［10］Li J，Qu X，Bertram JF.Endothelial-myofibroblast transition contributes to the early development of diabetic renal interstitial fibrosis in streptozotocin-induced diabetic mice［J］.Am J Pathol，2009，175(4):1380-1388.

［11］Zhou L，Xue H，Yuan P，Ni J，Yu C，Huang Y，et al.Angiotensin AT1 receptor activation mediates high glucose-induced epithelial-mesenchymal transition in renal proximal tubular cells［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2010，37(9):e152-e157.

［12］Massey AR， Miao L， Smith BN， Liu J，Kusaka I，Zhang JH，et al.Increased RhoA translocation in renal cortex of diabetic rats［J］.Life Sci，2003，72(26):2943-2952.

［13］Lee YJ，Han HJ.Troglitazone ameliorates high glucoseinduced EMT and dysfunction of SGLTs through PI3K/Akt，GSK-3β，Snail1，and β-catenin in renal proximal tubule cells［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2010，298(5):1263-1275.

［14］Lan HY.Tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation mechanisms in proximal tubule cells［J］.Curr Opin Nephrol Hypertens，2003，12(1):25-29.