周雨朦，朱春寶，陳代杰，李繼安

(中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海 200040)

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans，C.elegans)是一種經(jīng)典的模式生物，因其結(jié)構(gòu)簡單、通體透明、繁殖快、生命周期短和易于實驗室培養(yǎng)，被廣泛用于生命科學(xué)等領(lǐng)域。近年來，C.elegans又被用于藥物篩選研究和環(huán)境毒性檢測與生態(tài)毒理學(xué)研究。目前，已經(jīng)建立了 C.elegans高通量藥物篩選模型［1－3］和基于C.elegans的不同種類化合物篩選方法(如抗感染藥物［4－6］、小分子鈣離子通道拮抗劑［7］和抗衰老藥物［1］。在環(huán)境毒性檢測中，已初步建立了 C.elegans液態(tài)環(huán)境研究方法［8－9］;利用C.elegans檢測環(huán)境中化學(xué)試劑、重金屬離子等毒性［10－11］。但是，利用 C.elegans對各類藥物進行毒性評估，還沒有相關(guān)的研究報道。因此，本研究采用C.elegans對4大類抗感染抗生素，包括青霉素類、四環(huán)素類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類和3種抗腫瘤藥物進行毒性評估，統(tǒng)計經(jīng)過待測藥物處理若干時間后線蟲的存活率。這種存活率不僅反映待測藥物的綜合質(zhì)量，同時也反映了藥物隨時間在線蟲體內(nèi)的積累效應(yīng)。通過了解不同種類藥物對線蟲的毒性，掌握化合物毒性范圍，為進一步哺乳動物毒性實驗提供依據(jù)。初步建立非哺乳動物——C.elegans藥物急性毒性評價體系。

1 材料與方法

1.1 藥物和儀器

青霉素(penicillin)、苯唑西林鈉(oxacillin sodium)、氨芐西林(ampicillin)、紅霉素(erythromycin)、阿奇霉素(azithromycin)、鹽酸四環(huán)素(tetracycline hydrochloride)、鹽酸金霉素(chlortetracycline hydrochloride)、土霉素 (oxytetracycline)、鏈霉素(streptomycin)、妥布霉素(tobramycin)、卡那霉素(kanamycin)、硫酸慶大霉素(gentamicin sulfate)、硫酸西索米星(sisomicin sulfate)、阿米卡星(amikacin)和絲裂霉素C(mitomycin C)由本實驗室保藏，純度在99%以上。柔紅霉素(daunorubicin)和多柔比星(doxorubicin)購自Pharmacia＆Upjohn公司。NV-T型體視顯微鏡(配視頻攝像器)為上海精密儀器儀表有限公司產(chǎn)品。

1.2 秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)

C.elegans WT Bristol N2［12］由復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究所惠贈，glp-4(bn2ts);sek-1(km4)［6］由哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)部提供，均飼養(yǎng)于涂布E.coli OP50的標(biāo)準(zhǔn)線蟲培養(yǎng)基(NGM)［13］中。E.coli OP50采用 Luria-Bertani培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)進行培養(yǎng)。

1.3 藥物毒性的測定

將處于產(chǎn)卵階段的線蟲進行同期化處理［17］，從平板上收集孕蟲，清洗，最后剩約500μl蟲懸液，之后加入400μl漂白劑(5%NaClO)和100μl NaOH 5 mol·L－1，漩渦振蕩3～4 min至蟲體大部分溶解，然后加入無菌水稀釋，1300×g離心1 min，棄上層液體，再清洗1次，收集同步化生長的蟲卵。將蟲卵置于M9緩沖液［14］中15℃過夜孵育至 L1期。之后，將L1期線蟲轉(zhuǎn)接到覆有E.coli OP50的NGM培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)48～52 h到L4期(不孕階段)，用M9緩沖液將其從平板上洗下，重懸，清洗，收集蟲體進行藥物急性毒性實驗。本實驗全部采用處于幼蟲發(fā)育后期L4期的線蟲進行毒性考察實驗。

配制不同濃度梯度的待檢測藥物溶液(表1)。將100μl配制好的待測藥物溶液加入無菌的96孔板中，然后再轉(zhuǎn)入100μl含20條的線蟲溶液，最終毒性考察體系為200μl。每個藥物濃度梯度做3個復(fù)孔，以不含藥物的線蟲溶液體系作為空白對照。在染毒后第1天，統(tǒng)計線蟲存活率，之后每隔1 d，觀察線蟲的存活情況，直到第7天。線蟲身體僵直，用探針觸碰沒有反應(yīng)，判定為死亡。

Tab.1 Preparation of drugs

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗均重復(fù)3次，線蟲生存統(tǒng)計數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 5.01軟件。采用Kaplan-Meier方法進行生存分析，log-rank檢驗法對組間的數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。毒性實驗結(jié)果采用Origin Pro 8.0軟件處理分析，利用DoseResp函數(shù)進行擬合，并計算藥物半致死劑量(LC50)，并且采用t檢驗法進行組間差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 不同品系線蟲對藥物毒性的敏感度

實驗考察野生型N2和突變型glp-4;sek-1線蟲分別在含紅霉素250 mg·L－1、四環(huán)素或是多柔比星50 mg·L－1染毒體系中，7 d內(nèi)的存活情況。如圖1所示，在相同毒性體系中，glp-4;sek-1線蟲的死亡速率要大于N2線蟲的死亡速率。在紅霉素250 mg·L－1染毒體系中，N2線蟲的半數(shù)死亡天數(shù)為5 d，glp-4;sek-1線蟲的半數(shù)死亡天數(shù)為3 d(P＜0.01);在四環(huán)素 250 mg·L－1染毒體系中，N2 線蟲的半數(shù)死亡天數(shù)為7 d、glp-4;sek-1線蟲的半數(shù)死亡天數(shù)為 5 d(四環(huán)素 P＜0.01);在多柔比星50 mg·L－1染毒體系中，N2線蟲的半數(shù)死亡天數(shù)＞7 d、glp-4;sek-1線蟲的半數(shù)死亡天數(shù)為 3 d(P＜0.01)。結(jié)果表明兩種品系的線蟲對藥物毒性的敏感度具有顯著性差異，glp-4;sek-1與N2線蟲相比藥物的毒性更敏感。

Fig.1 Effect of EM，TC and Dox on N2 and glp-4;sek-1 survival rate.EM 250 mg·L －1;TC 250 mg·L －1;Dox 50 mg·L －1.

2.2 大環(huán)內(nèi)酯類藥物毒性

考察紅霉素和阿奇霉素對線蟲的急性毒性，選取染毒72 h后的數(shù)據(jù)進行函數(shù)擬合(圖2)，相關(guān)系數(shù)R2均在0.99左右，表明存在典型的劑量-效應(yīng)關(guān)系。紅霉素對N2和glp-4;sek-1線蟲的72 h半致死劑量〔LC50(72 h)〕分別 為 250 mg·L－1和120 mg·L－1;而阿奇霉素分別為 411 mg·L－1和286 mg·L－1。以上數(shù)據(jù)可以看出:① 在 N2和glp-4;sek-1線蟲評估體系中，紅霉素的毒性均要大于阿奇霉素毒性(P＜0.05)。此結(jié)果與小鼠急性毒性實驗結(jié)果相一致(表2)。②glp-4;sek-1與N2線蟲相比對紅霉素和阿奇霉素的藥物毒性更敏感。目前，glp-4;sek-1線蟲已用于抗細(xì)菌和真菌感染藥物的高通量篩選［2－3］。作為常用的藥物篩選模型，并且具有對藥物毒性敏感度強的特性，因此，后續(xù)研究均采用glp-4;sek-1線蟲考察藥物毒性。

Tab.2 Toxic index of testing drugs

Fig.2 Effect of EM and AZM on N2 and glp-4;Sek-1 survival rate.Data was fitted with DoseResp.

2.3 四環(huán)素類藥物的毒性

采用上述方法進行數(shù)據(jù)分析和擬合(R2均在0.99左右)，四環(huán)素、土霉素和金霉素的LC50(72 h)分別為316，383和359 mg·L－1(圖3)。在線蟲評估體系中，四環(huán)素、土霉素和金霉素的藥物毒性相當(dāng)，與資料顯示(表2)的小鼠口服急性毒性實驗結(jié)果相一致。

Fig.3 Concentration-response curve for the toxicity of TC，OTC and CTC.Data were fitted with DoseResp.

2.4 氨基糖苷類藥物的毒性

對6種氨基糖苷類藥物進行線蟲毒性考察，記錄染毒72 h后線蟲存活數(shù)據(jù)，對數(shù)據(jù)進行分析擬合(圖4)。6種藥物對線蟲的毒性大小為:妥布霉素＞慶大霉素＞西索米星＞鏈霉素＞卡那霉素＞阿米卡星;大致分為3個等級:阿米卡星和卡那霉素LC50(72 h)＞2000 mg·L－1;鏈霉素、西索米星和慶大霉素LC50(72 h)在 1000 mg·L－1左右;妥布霉素LC50(72 h)＜500 mg·L－1。與資料報道的氨基糖苷類藥物毒性作比較，發(fā)現(xiàn)在小鼠po和sc給藥急性毒性實驗中，妥布霉素毒性(LD50分別為10 500和441 mg·kg－1)相對西索米星毒性(LD50分別為5000和288 mg·kg－1)較小，而在線蟲體系中，妥布霉素的LC50(72 h)460 mg·L－1要大于西索米星的LC50(72 h)804 mg·L－1。表明某些藥物對線蟲的毒性相對較強，而對小鼠的毒性相對較弱，而對于具體的機制還有待進一步研究。但是總體上，線蟲評價的藥物毒性大小基本與小鼠相似(圖5)。

Fig.4 Effect of AMK，Kan，SM，Siso，GM and Tob on glp-4;sek-1 survival rate.Data was fitted with DoseResp.AMK:amikacin;Kan:kanamycin;SM:streptomycin;Siso:sisomicin sulfate;GM:gentamicin sulfate;Tob:tobramycin.

Fig.5 Trend curve of aminoglycoside antibiotic toxicity on mice and glp-4;sek-1.

2.5 青霉素類藥物的毒性

實驗考察青霉素、氨芐西林和苯唑西林在62.5 ～2000 mg·L－1濃度范圍內(nèi)對線蟲的毒性。實驗采集了第5天的線蟲存活數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)藥物濃度達(dá)到2000 mg·L－1時，所有染毒體系中線蟲的存活率仍在95%以上(圖6)。根據(jù)化合物毒性分級標(biāo)準(zhǔn)判定，3種藥物對線蟲幾乎沒有毒性，屬于低毒性化合物。

Fig.6 Effect of PV，Amp and OXSon glp-4;sek-1 survival rate.

2.6 抗腫瘤類藥物的毒性

考察3種抗腫瘤類藥物對線蟲毒性分別為:柔紅霉素 LC50(72 h)為 45.5 mg·L－1;多柔比星 LC50(72 h)為55.8 mg·L－1;絲裂霉素 C LC50(72 h)為43.8 mg·L－1。柔紅霉素、多柔比星和絲裂霉素 C對線蟲的毒性沒有顯著性差異(圖7)。與資料報道的小鼠評價體系相比，線蟲體系對這3種抗腫瘤藥物沒有很高的毒性區(qū)分度，并且絲裂霉素C對線蟲毒性和小鼠(LD50=23 mg·kg－1)相差不大。這3種抗腫瘤藥物的機制是抑制DNA生物合成，推測3種藥物對線蟲造成的毒性是一致的，因此，在線蟲評價體系中無法得到區(qū)分。

Fig.7 Effect of NDR，Dox and MMC on glp-4;sek-1 survival rate.Data was fitted with DoseResp.

3 討論

秀麗隱桿線蟲已被廣泛用于各類藥物篩選中，作為一個整體生物篩選模型對藥物的有效性進行評價。但是在對藥物進行有效性評價的同時，是否可以對其安全性進行初步評價。因此，本實驗采用線蟲在環(huán)境毒理學(xué)中研究的方法，對4大類抗生素和3種抗腫瘤藥物進行急性毒性評價，通過線蟲存活率，來反映藥物的急性毒性。大部分藥物在線蟲評價體系中呈現(xiàn)的毒性大小，與小鼠評價體系相類似。然而，線蟲作為黑箱式的評價系統(tǒng)，與哺乳動物相比存在一些不足之處，包括線蟲沒有心臟，呼吸系統(tǒng)，眼、耳和腎等器官，所以無法對藥物的具體毒性、損傷器官等進行評價，可能造成對某些藥物毒性相對敏感或相對不敏感的差異。鑒于線蟲與人類種間距離太遠(yuǎn)，線蟲的作用仍處在藥物研發(fā)和評價初期，為化合物快速粗篩和毒性評價提供線索。

總之，秀麗隱桿線蟲是一個很好的藥物毒性檢測器，通過監(jiān)測線蟲的死亡率來反映藥物急性毒性大小，對藥物的安全性進行初步評價。與小鼠評價模型相比，此評價系統(tǒng)操作簡單，監(jiān)測方便，周期短，投入少，更適合化合物高通量篩選和毒性預(yù)評估。

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