時 樂，徐 立，尹 蓮，曾凡偉，梅 琦

(南京中醫(yī)藥大學(xué)1.藥學(xué)院臨床藥學(xué)系，2.藥物安全性評價中心，江蘇南京 210046)

痛風(fēng)是由于嘌呤代謝紊亂和(或)尿酸排泄障礙所致的疾病。由于結(jié)締組織特別是軟骨和滑膜尿酸鹽結(jié)晶沉積而引起痛風(fēng)性急性關(guān)節(jié)炎反復(fù)發(fā)作，導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形，并且常累及腎和心臟，并引起多臟器損傷。隨著生活水平的不斷提高，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病率增加，防治痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎已經(jīng)成為備受關(guān)注的研究課題。本實(shí)驗(yàn)室曾對嚙齒類動物高尿酸血癥模型進(jìn)行系統(tǒng)的研究，成功地建立了小鼠和大鼠急性高尿酸血癥模型及大鼠持續(xù)性高尿酸模型［1－4］。但是由于臨床上并非所有高尿酸血癥患者均發(fā)生痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，且對誘發(fā)關(guān)節(jié)炎的因素尚不清楚，所以對痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動物模型的研究一直在摸索中。臨床上痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生有多種因素，如過量攝取高脂高蛋白飲食、食用豆制品或海鮮、喝啤酒及受寒冷潮濕等。飲食和飲酒等因素均為引發(fā)高尿酸血癥的直接因素，而根據(jù)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)作特點(diǎn)來看，患者多在夜間發(fā)作，可見低溫對高尿酸血癥誘發(fā)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎有一定的影響。本研究通過對持續(xù)性高尿酸血癥模型大鼠附加冷水泳浴條件，觀察冷水泳浴對高尿酸血癥大鼠誘發(fā)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的影響，為嚙齒類動物痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型的制備提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑和儀器

清潔級SD大鼠，雄性，體質(zhì)量250～290 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供，動物許可證號:SCXK(滬)2007-0005。氧嗪酸鉀，購自 Sigma-Aldrich公司，用羊毛脂與液體石蠟按質(zhì)量比3∶2在70℃下混合而成的溶劑配制;次黃嘌呤(hypoxanthine，HX)，購自南京鼎潤生物技術(shù)有限公司;尿酸測定試劑盒，購自上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司;液體石蠟，購自上海凌鋒化學(xué)試劑有限公司;羊毛脂，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲醛溶液，購自汕頭市西隴化工廠有限公司;水合氯醛，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。7020全自動生化分析儀(日本日立公司);多普勒激光微循環(huán)測定儀，美國Biopac公司。

1.2 動物分組與處理

將大鼠隨機(jī)分為正常對照組(n=8)、冷水泳浴組(n=8)、高尿酸血癥模型組(n=8)、高尿酸血癥+冷水泳浴組(n=30)。參照文獻(xiàn)［4］復(fù)制持續(xù)性高尿酸血癥大鼠模型。禁食24 h后，正常對照組和冷水泳浴組喂飼普通飼料，高尿酸血癥模型組和高尿酸血癥+冷水泳浴組喂飼含HX 100 g·kg－1飼料。次日早晨，sc給予氧嗪酸鉀1 ml·kg－1，每隔 48 h 注射1次，連續(xù)6次。從造模的第1天開始，每天9:00時，將冷水泳浴的大鼠放入10～12℃的水中10 min，每天1次，共12 d。

1.3 大鼠后肢腫脹率及腫脹發(fā)生率的測定

造模前，用足容積測定儀測量各組大鼠左、右后肢容積。造模期間，從大鼠后肢關(guān)節(jié)出現(xiàn)腫脹次日起至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，每天使用足容積測定儀測量各組大鼠雙側(cè)后肢容積，計算足容積均數(shù)作為造模后該大鼠后肢平均容積。關(guān)節(jié)腫脹率(%)=(造模后雙后肢容積－造模前雙后肢容積)/造模前雙后肢容積×100%。

1.4 微循環(huán)測定儀測定足面單位面積紅細(xì)胞矢量和血灌流單位(blood perfusion unit，BPU)

造模12 d后，將大鼠以10%水合氯醛麻醉后，仰位固定于鼠板上，穩(wěn)定1 min后，用多普勒微循環(huán)測定儀測大鼠右后肢足面單位面積紅細(xì)胞矢量和BPU，測定時間為2 min。

1.5 大鼠血清尿酸濃度的測定

分別于造模前和造模6和12 d后，各組大鼠于眼眶靜脈叢取血，每只0.5 ml，離心，取血清，全自動生化分析儀測定尿酸濃度。

1.6 大鼠踝關(guān)節(jié)尿酸濃度的測定

處死所有大鼠，剔除右側(cè)踝關(guān)節(jié)周圍肌肉，打開關(guān)節(jié)腔，用0.2 ml生理鹽水反復(fù)沖洗關(guān)節(jié)腔5次，測定踝關(guān)節(jié)液中尿酸濃度。

1.7 大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)觀察

取左側(cè)踝關(guān)節(jié)，10%甲醛溶液固定，經(jīng)15%EDTA脫鈣后，常規(guī)取材，脫水，石蠟包埋，切片厚4μm，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理變化。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 冷水泳浴對高尿酸血癥大鼠腫脹發(fā)生率及后肢關(guān)節(jié)腫脹率的影響

12 d實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，高尿酸血癥+冷水泳浴組大鼠死亡12只，其中有5只已經(jīng)出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹，且腫脹部位有紅腫、破潰和感染的癥狀，具體死亡原因有待進(jìn)一步探討。該組大鼠關(guān)節(jié)腫脹發(fā)生率為76.7%(23/30);其余各組均未見關(guān)節(jié)腫脹及死亡。

高尿酸血癥+冷水泳浴組大鼠造模后第4天，肉眼即可觀察到后肢關(guān)節(jié)開始出現(xiàn)紅腫;第5天起，該組大鼠出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹的例數(shù)增加并出現(xiàn)腫脹高峰，且一直維持至第8天，腫脹部位有紅腫、破潰的癥狀;第10天起，約半數(shù)腫脹大鼠紅腫自行緩解或消失。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，各組大鼠后肢平均關(guān)節(jié)腫脹率見表1，提示高尿酸血癥和冷水泳浴共同作用可引起大鼠后肢關(guān)節(jié)腫脹。

Tab.1 Effect of swimming in cold water on swelling in hind limbs of hyperuricemia rats

2.2 冷水泳浴對高尿酸血癥大鼠后肢足面微循環(huán)的影響

造模12 d后，與正常對照組比較，其余各組大鼠后肢微循環(huán)均表現(xiàn)為不暢(P＜0.01);其中高尿酸血癥+冷水泳浴組與冷水泳浴組和高尿酸血癥模型組比較，微循環(huán)阻滯更加明顯(P＜0.01)(表2);提示高尿酸血癥和冷水泳浴均可降低大鼠末梢微循環(huán)，兩種因素共同作用可導(dǎo)致更加嚴(yán)重的微循環(huán)障礙。

2.3 冷水泳浴對高尿酸血癥大鼠血清尿酸濃度的影響

造模6和12 d后，各組大鼠血清尿酸水平的變化見表3。與正常對照組比較，冷水泳浴組無明顯變化，高尿酸血癥模型組和高尿酸血癥+冷水泳浴組明顯升高(P＜0.01)。高尿酸血癥+冷水泳浴組與高尿酸血癥模型組比較無明顯變化，與冷水泳浴組比較顯著升高(P＜0.01)，提示冷水泳浴對大鼠血清尿酸水平無直接影響。

Tab.2 Effect of swimming in cold water on blood perfusion unit(BPU)in foot microcirculation of hyperuricemia rats

Tab.3 Effect of swimming in cold water on serum uric acid concentration in hyperuricemia rats

2.4 冷水泳浴條件對高尿酸血癥大鼠右踝關(guān)節(jié)腔尿酸濃度的影響

表4結(jié)果顯示，造模12 d后，與正常對照組比較，其余各組大鼠踝關(guān)節(jié)腔中尿酸濃度均明顯升高(P＜0.01);高尿酸血癥+冷水泳浴組明顯高于冷水泳浴組和高尿酸血癥模型組(P＜0.01);提示高尿酸血癥和冷水泳浴均可增加大鼠踝關(guān)節(jié)腔尿酸濃度;當(dāng)兩種因素同時存在時，其交互作用可增加大鼠踝關(guān)節(jié)腔尿酸鹽的沉積。

Tab.4 Effect of swimming in cold water on uric acid concentration in joint cavity of hyperuricemia rats

2.5 冷水泳浴對高尿酸血癥大鼠左側(cè)踝關(guān)節(jié)組織病理變化的影響

由圖1結(jié)果表明，正常對照組踝關(guān)節(jié)無明顯腫脹，滑膜完整、無增生，細(xì)胞排列整齊，無充血水腫，無炎癥細(xì)胞浸潤，關(guān)節(jié)腔內(nèi)無積液，關(guān)節(jié)軟骨完整，無破壞(圖1A)。冷水泳浴組踝關(guān)節(jié)無異常改變(圖1B)。高尿酸血癥模型組有1例滑膜內(nèi)血管擴(kuò)張充血，少許淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤，周圍軟組織血管擴(kuò)張充血(圖1C)。高尿酸血癥+冷水泳浴組約76.7%的踝關(guān)節(jié)腫脹，鏡下可見滑膜內(nèi)血管擴(kuò)張充血明顯，個別滑膜細(xì)胞輕度增生，伴有少量的炎癥細(xì)胞(有淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)浸潤，周圍軟組織血管擴(kuò)張充血，間質(zhì)水腫，伴有類似的炎癥細(xì)胞浸潤(圖1D)。

Fig.1 Effect of swimming in cold water on histopathological changes in ankle joints of hyperuricemia rats(HE ×40).A:normal control group;B:cold water group;C:hyperuricemia model group;D:hyperuricemia+cold water group.Arrows showed inflammatory cells invasion.

3 討論

目前國內(nèi)外制備痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動物模型主要采用將尿酸鹽直接注入動物關(guān)節(jié)腔的方法［5－6］，但上述方法所致腫脹僅為一種非特異性炎癥反應(yīng)，不同于臨床因代謝障礙而形成的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，對于痛風(fēng)的病理生化基礎(chǔ)——高尿酸血癥并未涉及，所以不能準(zhǔn)確評價抗痛風(fēng)藥物的作用和作用機(jī)制。為此許多學(xué)者試圖通過不同的方法建立一種符合臨床的、由嘌呤代謝紊亂所致的大鼠高尿酸血癥痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動物模型，但目前均未見有成功的報道。

高尿酸血癥是發(fā)生痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的基礎(chǔ)，但是臨床上并非所有高尿酸血癥患者均發(fā)生痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，可能存在其他誘發(fā)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的因素。為了進(jìn)一步探討這個問題，本實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)考察了溫度對尿酸鹽結(jié)晶沉積的影響，結(jié)果顯示低溫有利于尿酸鹽結(jié)晶的形成［7－8］。

本研究曾選取0℃水浴研究，結(jié)果大鼠死亡數(shù)較多，且凍傷嚴(yán)重。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，本研究最終選擇在高尿酸血癥大鼠模型基礎(chǔ)上附加大鼠可以耐受的適宜水溫10～12℃冷水泳浴。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，僅高尿酸血癥+冷水泳浴組大鼠發(fā)生了后肢關(guān)節(jié)腫脹，腫脹發(fā)生率約76.7%，組織病理學(xué)檢查主要表現(xiàn)為輕度的滑膜炎和周圍軟組織炎癥，關(guān)節(jié)腔中尿酸濃度明顯升高，并且受試大鼠后肢關(guān)節(jié)腫脹的過程與臨床痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程相似。上述結(jié)果表明，對高尿酸血癥模型大鼠附加冷水泳浴條件可誘發(fā)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。后期還將考察不同水溫對造模成功率的影響。

此外，本研究結(jié)果表明，冷水泳浴可使大鼠后肢微循環(huán)受阻，其受阻程度以合并高尿酸血癥大鼠尤為顯著，高尿酸血癥和冷水泳浴因素的加和是增加大鼠后肢關(guān)節(jié)腫脹發(fā)生率的主要因素。這可能是因?yàn)楹浯碳な咕植课⒀苁湛s使局部血流減慢，從而使高尿酸血癥患者的關(guān)節(jié)局部出現(xiàn)尿酸大量的聚集，關(guān)節(jié)局部pH降低刺激微血管，毛細(xì)血管和關(guān)節(jié)囊外層纖維結(jié)締組織通透性增加，致使尿酸得以向關(guān)節(jié)腔轉(zhuǎn)移和聚集，最終引發(fā)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。由此提示，高尿酸血癥大鼠肢體微循環(huán)障礙可能是導(dǎo)致尿酸鹽聚集于關(guān)節(jié)并引起關(guān)節(jié)炎癥的重要原因之一。

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