李 霞 楊穎博 李君麗 陳 程 陳萬(wàn)生 孫連娜▲

1.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433；2.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200403

HPLC法同時(shí)測(cè)定皺皮木瓜中原兒茶酸和綠原酸的含量

李 霞1，2楊穎博2李君麗1陳 程1陳萬(wàn)生2孫連娜1▲

1.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433；2.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200403

目的 建立皺皮木瓜中主要有效成分原兒茶酸和綠原酸的高效液相色譜含量測(cè)定方法。 方法 采用Dikma Diamonsil C18色譜柱 （4.6mm×250.0mm，5 μm），甲醇-0.1%甲酸水梯度洗脫，流速：1.0mL/min，柱溫：30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。 結(jié)果 原兒茶酸在 16.66～533.00 μg（r=0.999 9），綠原酸在 23.91～765.00 μg（r=0.999 5），線性關(guān)系良好；兩個(gè)化合物的平均回收率分別為100.11%（RSD=0.90%，n=6）及99.06%（RSD=0.52%，n=6）。 結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便快速，分離效果好，靈敏度高，重現(xiàn)性好，可為全面控制皺皮木瓜質(zhì)量提供參考。

木瓜藥材；高效液相色譜法；含量測(cè)定；原兒茶酸；綠原酸

皺皮木瓜為薔薇科木瓜屬植物貼梗海棠Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai的干燥成熟果實(shí)，主產(chǎn)安徽、山東、浙江、湖北、云南、貴州、四川等地。皺皮木瓜作為一種常用中藥，味酸，性溫，入肝、脾經(jīng)，具有舒筋活絡(luò)、和胃化濕的功效，主治風(fēng)濕痹痛、肢體酸重、筋脈拘攣、吐瀉轉(zhuǎn)筋、腳氣水腫等癥，臨床主要用于治療腰酸腿痛、霍亂、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、四肢轉(zhuǎn)筋、大吐瀉、腳氣水腫等疾病[1]。相關(guān)學(xué)者從木瓜中先后分離得到了有機(jī)酸類、三萜類、黃酮類等多種化學(xué)成分[2]。

筆者在對(duì)皺皮木瓜的研究中發(fā)現(xiàn)綠原酸與原兒茶酸是其中的主要成分。綠原酸，具有廣泛的利膽、抗菌、抗病毒、升高白細(xì)胞等作用；原兒茶酸，具有增加冠脈流量、降低心肌耗氧量、緩解心絞痛等作用[3-6]。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于皺皮木瓜藥材酚酸類成分的含量測(cè)定方法的文獻(xiàn)報(bào)道較少[7-11]，尚未見(jiàn)有關(guān)同時(shí)測(cè)定木瓜藥材中綠原酸和原兒茶酸含量的文獻(xiàn)報(bào)道。本文采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定了木瓜藥材中綠原酸與原兒茶酸的含量，為評(píng)價(jià)和控制木瓜藥材的質(zhì)量提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters液相色譜儀（PDA檢測(cè)器），Empower工作站；Sartorious BT 25S型1/10萬(wàn)電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；2500DE型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

原兒茶酸、綠原酸對(duì)照品均為自制（色譜檢查純度大于98%），甲醇為色譜醇，水為重蒸水，其他試劑均為分析純。16批木瓜藥材主要由山東、河南、安徽、四川等產(chǎn)地收集，經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)張漢明教授鑒定分別為皺皮木瓜Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai和光皮木瓜 C.sinensis（Thouin）Koehne的干燥近成熟果實(shí)，見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Dikma Diamonsil C18（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸（A）-甲醇（B）梯度洗脫，20%～25%A（0～25min），25%A（26～35 min），25%～20%A（36～40 min）；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：20 μL。依上述色譜條件，分別精密吸取原兒茶酸和綠原酸對(duì)照品溶液和供試品溶液各20μL，分別進(jìn)樣。在對(duì)照品溶液和供試品溶液色譜圖相應(yīng)位置上，有相同保留時(shí)間的色譜峰，見(jiàn)圖l。

表1 木瓜藥材信息表

2.2 供試品溶液的制備

取木瓜藥材細(xì)粉1 g，精密稱定，置具塞玻璃瓶中，精密加入20%甲醇20 mL，稱定重量，浸泡過(guò)夜后，超聲提取30min，放冷，再次稱定重量，用20%甲醇補(bǔ)足重量，過(guò)濾，取續(xù)濾液過(guò)0.45μm微孔濾膜再過(guò)濾，作為供試品溶液置于4℃冰箱保存。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取干燥后的原兒茶酸和綠原酸對(duì)照品分別為5.33、7.65mg，用20%甲醇溶解定容至10mL容量瓶，0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，續(xù)濾液即為對(duì)照品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察

將原兒茶酸、綠原酸對(duì)照品儲(chǔ)備液按 1/1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32比例制成6個(gè)不同濃度的對(duì)照品溶液，各依法進(jìn)樣20μL，測(cè)定各色譜峰峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 四種對(duì)照品的回歸方程和線性范圍

2.5 精密度考察

取木瓜藥材細(xì)粉按“2.2”項(xiàng)下方法，制備供試品溶液。在“2.1”項(xiàng)下色譜條件，取供試品溶液進(jìn)樣20μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，測(cè)定原兒茶酸和綠原酸色譜峰峰面積的RSD分別為1.58%和1.03%，表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性考察

取“2.5”項(xiàng)下供試品溶液，分別于制備后 0、2、4、8、16、24 h安排進(jìn)樣，每次20μL，記錄峰面積，測(cè)定原兒茶酸、綠原酸色譜峰峰面積的RSD分別為1.83%和1.64%，表明樣品在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性考察

取同一批木瓜藥材細(xì)粉，精密稱定6份，按“2.2”項(xiàng)下制備6份供試品溶液，平行測(cè)定，計(jì)算原兒茶酸平均含量為0.054（RSD=1.27%），綠原酸平均含量為 0.152（RSD=1.78%），表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率考察

稱取已知含量的木瓜藥材細(xì)粉6份，每份約1 g，精密稱定，分別精密加入一定濃度的兩個(gè)對(duì)照品，按“2.2”項(xiàng)下制成供試品溶液，每份樣品進(jìn)樣20μL，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表 3、4。

表3 原兒茶酸加樣回收率

表4 綠原酸加樣回收率

2.9 樣品含量測(cè)定

精密稱取16批不同產(chǎn)地及品種木瓜藥材各3份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算兩種成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

3.1.1 流動(dòng)相的選擇 預(yù)實(shí)驗(yàn)中分別考察了甲醇-水系統(tǒng)，乙腈-水系統(tǒng)和甲醇-0.1%甲酸水系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)甲醇-0.1%甲酸水系統(tǒng)分離效果比較好，各色譜峰都得到了較好的分離，為了保證在適宜的分析時(shí)間內(nèi)使各色譜峰均達(dá)到較好的分離，故采用甲醇-0.1%甲酸水系統(tǒng)梯度洗脫。

3.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 實(shí)驗(yàn)中用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)了原兒茶酸和綠原酸的檢測(cè)波長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)原兒茶酸在254 nm處有最大吸收，綠原酸的最大吸收雖然在327 nm，但是在254 nm處有肩峰，為了同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)化合物的含量，故選擇254 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.1.3 柱溫的考察 實(shí)驗(yàn)中考察了25、30、35℃三種柱溫，結(jié)果表明：溫度為30℃時(shí)，原兒茶酸和綠原酸的分離度較好。

3.1.4 流速的考察 實(shí)驗(yàn)中考察了不同的流速。當(dāng)流速為0.8mL/min時(shí)，峰形展寬；流速為1.2mL/min時(shí)，峰形改善不大，考慮到柱壓，最終確定流速為1.0mL/min。

3.2 含量測(cè)定結(jié)果分析

根據(jù)樣品測(cè)定結(jié)果，不同品種的木瓜藥材成分有明顯差異，在皺皮木瓜中都含有化合物原兒茶酸和綠原酸，而光皮木瓜中只有原兒茶酸，未檢測(cè)到綠原酸。而不同產(chǎn)地的相同品種的木瓜藥材中這兩種成分的含量差異也比較大，山東各產(chǎn)地的皺皮木瓜中原兒茶酸和綠原酸成分的含量相對(duì)較高，各產(chǎn)地氣候、土壤等環(huán)境條件可能是影響含量的重要因素。

本研究同時(shí)測(cè)定了木瓜藥材中主要成分原兒茶酸、綠原酸的含量，結(jié)果顯示該方法靈敏度高，重復(fù)性好，樣品處理方法簡(jiǎn)單，為木瓜藥材的質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：57.

[2]吳虹，魏偉，吳成義.木瓜化學(xué)成分及藥理活性的研究[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，23（2）：62-64.

[3]國(guó)家醫(yī)藥管理局中草藥情報(bào)中心站.植物藥有效成分手冊(cè)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1998：209-210.

[4]季字彬.中藥有效成分藥理與應(yīng)用[M].哈爾濱：黑龍江科學(xué)技術(shù)出版杜，1995：110.

[5]江蘇省植物研究所，中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物資源開(kāi)發(fā)研究所.新華本草綱要[M].3冊(cè).上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1990：95.

[6]饒曼人.原兒茶酸對(duì)缺血區(qū)心肌代謝及心肌梗塞范圍的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)報(bào)，1988，9（1）：27-30.

[7]龔復(fù)俊，陳玲，盧笑叢，等.皺皮木瓜果實(shí)中有機(jī)酸成分的GC-S分析[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2005，14（4）：55-56，58.

[8]陶君彥，張曉昱，黃志軍，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定木瓜中綠原酸、咖啡酸的含量[J].中國(guó)藥房，2007，18（12）：912-914.

[9]李榮華，高逢喜，任貽軍.RP-HPLC法測(cè)定木瓜中原兒茶酸的含量[J].中國(guó)藥師，2010，13（2）：179-180.

[10]陳建真，敖志輝，陳建明.不同產(chǎn)地木瓜及其酒制品中綠原酸的HPLC含量測(cè)定研究[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2010，39（1）：86-88.

[11]陳洪燕，萬(wàn)明，嚴(yán)宜昌，等.兩種產(chǎn)地木瓜不同處理方法的HPLC指紋圖譜研究[J].湖北中醫(yī)雜志，2010，32（2）：72-73.

Simultaneous determ ination of protocatechuic acid and chlorogcnic acid in Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakaiby HPLC

LIXia1,2 YANG Yingbo2 LIJunli1 CHEN Cheng1 CHENWansheng2 SUN Lianna1▲
1.SchoolofPharmacy,theSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai 200433,China;2.DepartmentofPharmacy,Changzheng Hospital Affiliated to the Second Military Medical University,Shanghai 200403,China

Objective To develop an HPLCmethod for the simultaneous quailtitation of protocatechuic acid and chlorogcnic acid in Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai.MethodsSamples were analyzed on Dikma Diamonsil C18column(4.6 mm×250.0mm,5μm),eluted withmethanol and water containing 0.1%formic acid asmobile phases in a linear gradientmode.The flow rate was kept at 1.0 mL/min and the column temperature was set to 30℃,the detector wavelengthswere 254 nm.ResultsThe linear rangeswere 16.66-533.00μg(r=0.999 9)for protocatechuic acid,23.91-765.00μg(r=0.999 5)for chlorogcnic acid.The average recoveries of the two constituents were 100.11%(RSD=0.90%,n=6),99.06%(RSD=0.52%,n=6),respectively.ConclusionThemethod is sensitive,accurate,repeatable,and can be used for quality control of the fruits of Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai.

Chaenomeles speciosa;HPLC;Content determination;Protocatechuic acid;Chlorogcnic acid

O657.63

A

1673-7210（2012）12（a）-0110-03

國(guó)家科技重大專項(xiàng)子課題-重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2011 ZX09102-006-03）。

李霞（1982-），女，碩士研究生，主管藥師；研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)與中藥新藥。

▲通訊作者

2012-09-19 本文編輯：衛(wèi) 軻）