肖 娟 鄔 靜，2 屠 迪，2 袁 慧，2 文利新，3 李榮芳※，2

由于卵巢顆粒細(xì)胞通過凋亡和激素分泌在生殖過程中起著非常重要的作用，因此對顆粒細(xì)胞的研究越來越受到人們的重視，加上生殖系統(tǒng)的調(diào)控機制相當(dāng)復(fù)雜，很難直接通過動物實驗探討相關(guān)受試化合物的毒理學(xué)作用機制。因此，本次實驗建立大鼠卵巢顆粒細(xì)胞體外原代培養(yǎng)體系，為研究毒物對生殖系統(tǒng)造成毒性的作用機理提供有效的體外模型。

1.材料與方法

1.1 實驗動物 (21～29)天齡未成熟雌性wistar大鼠，體重80±20g，SPF級，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司。胎牛血清(FBS)購自四季青公司。孕馬血清(PMSG)購自北京海德創(chuàng)業(yè)。四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自Amresco公司。大鼠孕酮(P)和雌二醇(E2)ELISA檢測試劑盒購自Rapidbio.Lab公司。卵泡刺激素受體(FSHR)免疫組化檢測試劑盒購自博士德公司。

1.3 主要儀器 倒置顯微鏡、生物顯微鏡，CO2培養(yǎng)箱、全自動高壓滅菌器，超凈工作臺，臺式離心機，多功能酶標(biāo)儀。

2.方法

2.1 Wistar大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 每只wistar大鼠一次性皮下注射PMSG 40IU，作用48小時，頸椎脫臼處死。打開腹腔，在無菌條件下迅速取出雙側(cè)卵巢，40倍解剖顯微鏡下眼科剪剪破有腔卵泡，輕輕拍打與擠壓，使卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞同時逸出，反復(fù)輕輕吹打使顆粒細(xì)胞釋放進入預(yù)冷的DMEM培養(yǎng)基中。200目不銹鋼細(xì)胞篩過濾，1000rpm、10分鐘離心后，在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中重懸并記數(shù)，苔盼藍染色檢測細(xì)胞活力，細(xì)胞活力＞90%，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105cells/ml，接種于6孔板，置于37℃，5%CO2濃度，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔48小時更換培養(yǎng)液，倒置顯微鏡下觀察、拍照。

2.2 Wistar大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的鑒定

2.2.1 顆粒細(xì)胞的HE染色 取重懸的顆粒細(xì)胞接種于24孔板中，每孔接種1×105個細(xì)胞，放入CO2培養(yǎng)箱中，在37℃，5%CO2濃度，飽和濕度下進行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長至鋪滿蓋玻片70%～80%時取出玻片;用PBS洗玻片，5分鐘×3次;4%多聚甲醛固定20分鐘，取出玻片，PBS洗玻片，5分鐘×3次;蘇木素染色2分鐘，流水沖去浮色;入鹽酸酒精中分色數(shù)秒，流水小心沖洗;顯微鏡下觀察細(xì)胞核清晰，胞漿不著色;5%伊紅染色(2～3)分鐘，流水沖去浮色;梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封面后顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，拍照。

2.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)法觀察FSHR蛋白表達 用于檢測的細(xì)胞爬片制作同前，4%多聚甲醛固定20分鐘，固定好的玻片，PBS洗滌5分鐘×3次;3%雙氧水于室溫下孵育5分鐘，PBS洗滌5分鐘×3次;加正常的山羊血清，封閉無關(guān)的抗原，室溫下孵育20分鐘，傾去不洗;于玻片上滴加一抗FSHR兔多克隆抗體(1∶200)，置于濕盒中4℃過夜，PBS洗滌5分鐘×3次;滴加二抗IgG，37℃孵育60分鐘;PBS洗滌5分鐘×3次。滴加辣根過氧化酶標(biāo)記的鏈霉素工作液50μl，37℃孵育30分鐘;PBS洗滌5分鐘×3次。于玻片上滴加DAB顯色液，在顯微鏡下觀察控制顯色時間;流水沖洗，蘇木素復(fù)染(5～10)分鐘;流水沖洗3次;常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片后顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，拍照。

2.2.3 顆粒細(xì)胞生長曲線的測定 取重懸的顆粒細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，每孔接種2×104個細(xì)胞，每天接種4孔，連續(xù)接種8天，于第9天加入 MTT溶液10μL，置于CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)4小時后取出，小心用移液槍吸出上清液，每孔加入DMSO 150μL，于振蕩器震蕩10分鐘，使細(xì)胞內(nèi)MTT藍紫色結(jié)晶完全溶解，在酶標(biāo)儀570nm波長處進行比色、讀數(shù)，測出每孔吸光度值(OD值)，取4孔平均值，實驗重復(fù)3次。以培養(yǎng)時間為橫軸，吸光值為縱軸，繪制細(xì)胞生長曲線。

2.2.4 顆粒細(xì)胞激素分泌情況的測定 取重懸的顆粒細(xì)胞接種于24孔板內(nèi)，每孔接種1×105個細(xì)胞，共接種3孔，加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基(含有10ng/ml FSH、3ng/ml雄烯二酮)，置于CO2培養(yǎng)箱中，在37℃，5%CO2濃度，飽和濕度下進行培養(yǎng)，每隔24小時更換并收集培養(yǎng)液放于－80℃保存，連續(xù)收集8天，最后進行孕酮(P)和雌二醇(E2)含量的檢測，按照ELISA檢測試劑盒的說明書進行操作。

3.結(jié)果

3.1 Wistar大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 顆粒細(xì)胞從卵泡中釋放出來時，鏡下觀察呈圓形，表面可見黑色顆粒，約(4～6)小時貼壁，48小時后置于倒置顯微鏡下觀察，可見細(xì)胞生長呈星狀或梭狀，細(xì)胞與細(xì)胞間有延長的絲狀偽足相互連接，細(xì)胞核大而圓，胞質(zhì)富含空泡及顆粒，細(xì)胞聚集生長，96小時左右基本鋪滿培養(yǎng)瓶底部，見圖1。

圖1 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞原代培養(yǎng)圖(200×)

3.2 Wistar大鼠卵巢顆粒細(xì)胞體外生長曲線 MTT法測得的細(xì)胞生長曲線見圖2。由圖可見，卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)初期隨著培養(yǎng)時間的延長而增殖，培養(yǎng)24小時內(nèi)細(xì)胞處于貼壁生長適應(yīng)期，24小時后OD值開始大幅度的增高，判斷細(xì)胞迅速進入對數(shù)生長期，到120小時細(xì)胞生長極度旺盛，OD值達到最大值;隨后逐漸下降，第168小時開始，出現(xiàn)類似成纖維細(xì)胞的形態(tài)，培養(yǎng)168小時以后，細(xì)胞開始退化，第192小時結(jié)束時的吸光度測定。

圖2 顆粒細(xì)胞體外生長曲線

3.3 Wistar大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的鑒定

3.3.1 HE染色 HE染色在鏡下可見貼壁細(xì)胞形態(tài)完整，體積較大，邊緣清晰，大小均一，呈多角形或梭形，細(xì)胞漿和細(xì)胞核染色均勻，核染深藍色呈卵圓形或不規(guī)則形，位于細(xì)胞中央，胞漿淡紅色并含有許多顆粒，見圖3。

圖3 顆粒細(xì)胞HE染色

3.3.2 FSHR免疫細(xì)胞化學(xué)法 FSHR陽性染色主要位于細(xì)胞胞漿，呈棕褐色著染，細(xì)胞核呈深藍色，鏡下可見FSHR的陽性率＞90%(見圖4)，由此表明分離培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞純度達到90%以上。

圖4 顆粒細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)染色

3.3.3 顆粒細(xì)胞的激素分泌 ELISA法測得顆粒細(xì)胞P和E2的體外分泌情況見圖5，激素的分泌趨勢與細(xì)胞的生長情況基本一致，于在(96～120)小時左右達到峰值，隨后逐漸下降。

圖5 顆粒細(xì)胞體外激素分泌情況

4.討論

目前，研究者對卵巢細(xì)胞的培養(yǎng)已不僅僅應(yīng)用于生殖生理方面的研究，在生殖病理、毒理等的研究方面也有重大的作用［1］。因此，研究顆粒細(xì)胞是研究卵母細(xì)胞成熟的一個很好的切入點［2］。體外培養(yǎng)的卵巢細(xì)胞為研究毒物對生殖系統(tǒng)造成毒性的作用機理提供了有效的體外模型。新生大鼠顆粒細(xì)胞在離體前未接觸過內(nèi)源性促性腺激素的刺激，采用PMSG刺激雌性wistar大鼠使之處于動情前期，獲得大量相同發(fā)育階段的顆粒細(xì)胞。體外培養(yǎng)(4～6)小時后顆粒細(xì)胞開始貼壁生長，(48～96)小時內(nèi)細(xì)胞大量增殖，生長旺盛，并可獲得較高的細(xì)胞存活率，實驗結(jié)果與文獻報道一致［3］。原代細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)勢在于最大程度地保存了細(xì)胞的特性，使體外實驗結(jié)果更符合于體內(nèi)的情況。

卵巢顆粒細(xì)胞是雌性動物卵巢內(nèi)唯一表達FSHR的細(xì)胞［4］，可以應(yīng)用FSHR免疫細(xì)胞化學(xué)染色對卵巢顆粒細(xì)胞的進行特異性染色。因此，本研究采用免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定顆粒細(xì)胞表面FSHR的表達，以此作為原代培養(yǎng)顆粒細(xì)胞的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。研究結(jié)果表明，于體外建立的卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)體系中，F(xiàn)SHR的陽性率可達到90%以上，可以進行相關(guān)實驗，所獲得的實驗數(shù)據(jù)也相對可信。

顆粒細(xì)胞是卵泡內(nèi)的最大細(xì)胞群，也是主要的功能細(xì)胞，卵泡發(fā)育的顯著標(biāo)志之一就是顆粒細(xì)胞迅速生長及增殖，而成年動物的卵泡閉鎖主要是由顆粒細(xì)胞凋亡引起，尤其在卵泡發(fā)育后期，此外，顆粒細(xì)胞還與卵泡膜細(xì)胞共同完成卵巢激素的合成，維持著有利于卵母細(xì)胞生長和成熟的微環(huán)境［5～8］。雌激素在體內(nèi)有著廣泛的效應(yīng)，包括:調(diào)控性成熟，控制排卵，調(diào)節(jié)生殖行為，建立和維持妊娠，調(diào)節(jié)乳腺發(fā)育等。而孕激素能拮抗雌激素的作用，孕激素對E2生殖效應(yīng)的拮抗作用涉及到多個方面，包括抑制雌激素誘導(dǎo)的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的轉(zhuǎn)位、改變雌激素受體的表達，并能誘導(dǎo)雌激素分解代謝的酶［9］。由此可見，顆粒細(xì)胞與卵泡膜細(xì)胞之間的相互作用是卵泡發(fā)育和卵巢激素合成的基礎(chǔ)［10］，它們可通過間隙連接，以自分泌和旁分泌的方式，維持有利于卵母細(xì)胞生長和成熟的微環(huán)境，提示顆粒細(xì)胞在卵巢局部微環(huán)境調(diào)節(jié)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。實驗過程中，在FSH作用下，顆粒細(xì)胞維持著一定的孕酮和雌二醇分泌水平，在(96～120)小時達到峰值，與體內(nèi)生理情況相符，說明原代培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞保持了原有細(xì)胞的特性。

綜上所述，卵巢顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)在生殖毒性研究方面有良好的應(yīng)用前景。本實驗所建立的細(xì)胞培養(yǎng)體系是可行的、理想的，適合進行相關(guān)的毒理學(xué)實驗。如果可獲得人的卵巢組織并進行培養(yǎng)，可直接用于對人體生殖毒性的研究，無疑意義重大。

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