郭 銳，范永仙，陳小龍

(浙江工業(yè)大學 發(fā)酵工程研究所，浙江 杭州 310014)

氟苯尼考是動物專用廣譜抗生素，在畜牧業(yè)中常以飼料添加劑等方式廣泛用于豬、牛、魚類及禽類等動物細菌性疾病的預防和治療，1999年我國批準氟苯尼考為國家二類新獸藥，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中用于治療鰻鱺愛德華氏病和赤磷病［1-4］。D-蘇式-對甲砜基苯絲氨酸乙酯 (D-threo-p-MPSE)是合成氟苯尼考的重要中間體之一，而其對映異構(gòu)體L-蘇式-對甲砜基苯絲氨酸乙酯(L-threo-p-MPSE)的治療活性非常差。目前獲得D-threo-p-MPSE 的方法大多通過“對甲砜基苯絲氨酸途徑”和“對甲砜基苯絲氨酸銅途徑”［5-6］。相比化學法，通過酶法手性拆分獲得該中間體具有高效、無污染，反應條件溫和等優(yōu)勢。利用酶法途徑獲得D-threo-p-MPSE 在國內(nèi)外尚無報道。但國外有為數(shù)不多的對于p-MPSE 結(jié)構(gòu)類似物對甲硫基苯絲氨酸乙酯酶法拆分的報道［7-9］。

本研究確立了脂肪酶水解拆分DL-蘇式-對甲砜基苯絲氨酸乙酯 (DL-threo-p-MPSE)的適合脂肪酶及反應體系，通過對反應條件的探索及優(yōu)化，初步獲得相對較優(yōu)的拆分條件?，F(xiàn)將有關(guān)結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、供試脂肪酶及試劑

高效液相色譜儀，LC-20AT，島津;恒溫水浴搖床，THZ-82，常州溴化儀器有限公司。擴展青霉脂肪酶、酵母脂肪酶、黑曲脂肪酶、豬胰脂肪酶購于北京凱泰新世紀生物技術(shù)有限公司;lipozyme TL IM、Novzyme 435 脂肪酶 (Candida Antarctica lipase)購于Sigma Aldrich 公司;M1，5-1，5-2，5-3，7-5，11-1 脂肪酶凍干產(chǎn)物由本實驗室篩選所得的脂肪酶菌株中制得。DL-threo-p-MPSE 由浙江康牧藥業(yè)有限公司提供。其余試劑均為市售AR試劑。

1.2 脂肪酶水解反應體系

酶反應在50 mL 三角搖瓶中進行，初始反應體系為:9.5 mL 脫水有機溶劑+0.5 mL Tris-HCl 緩沖液 (20 mmol，pH 值7.5);25 mg DL-threo-p-MPES;25 mg 商品酶或75 mg 菌種篩選所得脂肪酶凍干產(chǎn)物。反應條件為:在恒溫水浴搖床中30℃，140 r·min-1下反應120 h。

1.3 檢測分析方法

手性柱:DAICEL CHIRALCEL OJ-3 (4.6 mm×250 mm，particle size 3 μm);流動相:正己烷-乙醇 (60 ∶ 40，V/V，0.5%二乙胺);流速:1.0 mL·min-1;檢測波長:226 nm。進樣樣品處理:從反應體系中取100 μL 反應混合液，將反應混合液蒸干，加入甲醇-正丙醇 (1∶1，V/V)混合溶液1 mL，即將原樣品稀釋10 倍。

脂肪酶不對稱水解拆分DL-threo-p-MPSE 將不需要的L-構(gòu)型底物水解成對L-蘇式-甲砜基苯絲氨酸從而得到未被水解的對映體純的 D-threo-p-MPSE。

底物轉(zhuǎn)化率C 為反應后底物的剩余量與反應前底物總量之比;底物對映體過量百分數(shù) (e.e.s)用于考察外消旋底物拆分情況，由公式e.e.s/%=［(［D］-［L］)/ (［D］+［L］)］×100 來計算，其中［D］，［L］分別表示D-threo-p-MPES 與L-threo-p-MPES 由色譜峰面積計算而得的在反應體系中的濃度;E 值表示一種酶針對一種底物的對映體選擇性情況，由公式E=ln ［(1-C) (1-e.e.s)］/ ln ［(1-C)(1+e.e.s)］來計算，其中C 表示底物的轉(zhuǎn)化率。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應體系的選擇

threo-p-MPES 能在水中地自發(fā)水解且發(fā)生系列副反應 (包括retro-aldol 反應)、形成系列副產(chǎn)物(其中主副產(chǎn)物為對甲砜基苯甲醛)，因此采用有機溶劑微水相體系。根據(jù)threo-p-MPES 的溶解情況，選擇對其有相應溶解性的有機溶劑，在反應120 h 后，除了在叔丁醇體系中不同脂肪酶能夠不同程度地催化threo-p-MPES 水解外，在其他有機溶劑中，各脂肪酶均未能表現(xiàn)出催化threo-p-MPES 酶活性。因此，叔丁醇被作為最佳的微水反應介質(zhì)進行脂肪酶不對稱水解threo-p-MPES 的研究。

2.2 脂肪酶的確定

對于現(xiàn)有脂肪酶的考察發(fā)現(xiàn)，Novzyme 435 表現(xiàn)出了最好的催化及拆分效果，反應72 h 后，轉(zhuǎn)化率為35.95%，e.e.s 及E 值分別為35.13% 及6.08。在青霉脂肪酶催化體系中，幾乎大部分DLthreo-p-MPES 被用于生成副產(chǎn)物赤式對甲砜基苯絲氨酸乙酯以及對甲砜基苯甲醛，這很可能因為青霉更傾向于扮演催化threo-p-MPES 發(fā)生retro-aldol 反應的角色。其余脂肪酶未能表現(xiàn)出酶活或者拆分效果不佳。選用Novzyme 435 作為threo-p-MPES 不對稱水解的最佳酶源。

2.3 e.e.s 隨時間的變化

如圖1 所示，e.e.s 隨著反應的進行不斷上升，當反應進行144 h 時，轉(zhuǎn)化率達到58.58% 時，e.e.s 為70.08%，說明Novzyme 435 可同時水解D與L 2種構(gòu)型對映異構(gòu)體，且優(yōu)先水解L-threo-p-MPSE。當轉(zhuǎn)化率過半時，Novzyme 435 對于DLthreo-p-MPSE 的手性拆分效果未達到理想e.e.s 達90%以上。綜合考慮轉(zhuǎn)化率及e.e.s，將144 h 作為最合適的酶反應時間進行后續(xù)研究。

2.4 底物濃度的影響

通過在單位體積酶反應體系中添加不同濃度的DL-threo-p-MPSE 來考察底物濃度對于反應的影響。如于2.5 mg·mL-1時，轉(zhuǎn)化率及e.e.s 開始隨著濃度的增加而顯著減少 (圖2)。其原因:存在一定程度的底物抑制情況;當?shù)孜餄舛冗_到3.5 mg·mL-1時，底物的溶解性開始下降，有一定的底物從體系析出，從而對轉(zhuǎn)化率產(chǎn)生了一定的影響。E值在整個過程中不斷地下降，說明底物濃度越低，酶的對映體選擇性越高。在底物濃度為2.5 mg·mL-1時，底物的轉(zhuǎn)化率、e.e.s 均達到了最高，且此濃度對酶的對映體選擇性影響甚微，2.5 mg·mL-1為反應的最適底物濃度。

2.5 擴散效應的影響

2.5.1 內(nèi)擴散

內(nèi)擴散可通過固定化酶的加量來考察，若酶的濃度遠遠小于體系中底物濃度所對應的理論飽和酶濃度時，底物轉(zhuǎn)化率便隨著酶濃度的增加而增加;加大的酶量可以分擔部分內(nèi)擴散阻力，從而加快酶反應速率。如圖3所示，在加酶量小于2.0 mg ·mL-1時，轉(zhuǎn)化率隨著酶量的增加而顯著增加，此時從圖3 中可以看出存在輕微的內(nèi)擴散限制。當酶加量＞2.0 mg ·mL-1時，隨著酶加量的增加，轉(zhuǎn)化率增幅明顯放緩。因此，2.0 mg ·mL-1為相對于2.5 mg ·mL-1最佳底物濃度的飽和酶濃度。若繼續(xù)添加酶量仍可適量地促進轉(zhuǎn)換率與e.e.s，其部分原因是消除了固定化酶內(nèi)擴散限制。由于Novzyme 435 固定化酶價格昂貴，出于能效比及節(jié)省考慮，將2.0 mg·mL-1作為最適酶濃度。

圖2 脂肪酶不對稱水解拆分DL-threo-p-MPSE底物濃度對轉(zhuǎn)化率、e.e.s 及E 值的影響

圖3 脂肪酶不對稱水解拆分DL-threo-p-MPSE酶添加量對轉(zhuǎn)化率的影響

2.5.2 外擴散

外擴散因素可通過改變搖床轉(zhuǎn)速來研究。如圖4 所示，當轉(zhuǎn)速達到160 r·min-1時，轉(zhuǎn)化率和e.e.s 達到了最大值，若再提高轉(zhuǎn)速，對于轉(zhuǎn)化率無太大的改善，說明當轉(zhuǎn)速在160 r·min-1時，外擴散不再是限速因素。

2.6 微水有機溶劑水含量的影響

圖4 脂肪酶不對稱水解拆分DL-threo-p-MPSE搖床轉(zhuǎn)速對轉(zhuǎn)化率的影響

水含量是通過水活度來影響酶反應的。在有機溶劑中，結(jié)合于酶分子表面的水層能夠維持酶發(fā)揮活性所必須的催化活性構(gòu)象，適合的水含量能夠維持酶分子的剛性及熱力學穩(wěn)定性，從而使酶處于較高的活性與對映體選擇性。如表1 所示，當含水量從5.0%降低至0.2%，E 值呈明顯的上升趨勢。當含水量繼續(xù)下降時，E 值增加不再明顯，說明0.2%的含水量已能夠滿足維持酶剛性結(jié)構(gòu)所必須的表面層水含量。0.2% 為Novzyme 435 在叔丁醇體系中催化DL-threo-p-MPSE 不對稱水解的最佳含水量。在此含水量下，底物轉(zhuǎn)化率比5.0%的含水量時要低17% 左右，需在反應時間上作彌補，將最佳反應時間變?yōu)?92 h。在經(jīng)歷192 h 反應后，在0.2%含水量叔丁醇體系中，底物轉(zhuǎn)化率達到了64.52%，e.e.s 達到了86.28%.

表1 微水體系中水含量對轉(zhuǎn)化率、e.e.s 及E 值的影響

2.7 水相pH 值的影響

pH 值因素通過酶分子表面水層微環(huán)境改變酶的構(gòu)象從而影響酶的各類活性。如圖5 所示，當pH 值達到8.0 時，E 值相對達到最大，此時底物e.e.s 達92.54%。

2.8 溫度的影響

圖5 脂肪酶不對稱水解拆分DL-threo-p-MPSE pH 值對轉(zhuǎn)化率、e.e.s 及E 值的影響

如圖6 所示，溫度對于Novzyme 435 不對稱水解DL-threo-p-MPSE 的影響非常大。當溫度升高至37℃時，E 值從7.45 陡然下降到了3.37;底物e.e.s 也隨著溫度的升高下降明顯。e.e.s 下降的主要原因有:高溫促使酶剛性結(jié)構(gòu)下降，對映體選擇性也隨之下降;當處于37℃以上的溫度時，在脂肪酶水解環(huán)境下，底物會處于不穩(wěn)定狀態(tài)，α-C 與β-C 之間的碳碳鍵容易斷裂，大量底物被用于生成副產(chǎn)物對甲砜基苯甲醛而非p-MPS。后者是造成Novzyme 435 E 值下降的主要原因。因此，從酶的對映體選擇性及防止副反應的角度出發(fā)，最佳酶反應溫度宜為30℃。

圖6 脂肪酶不對稱水解拆分DL-threo-p-MPSE溫度對轉(zhuǎn)化率、e.e.s 及E 值的影響

2.9 Zn2+對轉(zhuǎn)化率及對映體選擇性的影響

我們發(fā)現(xiàn)Zn2+在Novzyme 435-叔丁醇催化反應體系中能夠有效抑制底物系列副反應的發(fā)生。如圖7 所示，Zn2+的加入可以大幅度地提高底物的轉(zhuǎn)化率，但Novzyme 435 對于DL-threo-p-MPES 的對映體選擇性大幅下降。對于對映體選擇性下降的原因，有如下2種推測:Zn2+能夠降低酶的剛性結(jié)構(gòu)，從而促進酶的非選擇性水解;在Zn2+體系反應至48 h 后，體系中產(chǎn)生了大量的白色p-MPS 絡合沉淀，說明體系中溶解在溶劑中的產(chǎn)物p-MPS的濃度維持在了一個非常低的水平，一方面酶的不對稱水解增加，另一方面，底物自身在微水叔丁醇有機溶劑中同樣發(fā)生了非酶、純化學水解，從而造成了Novzyme 435 E 值大幅度下降的表觀現(xiàn)象。

圖7 脂肪酶不對稱水解拆分DL-threo-p-MPSE Zn2+對轉(zhuǎn)化率及對映體選擇性的影響

3 小結(jié)與討論

因DL-threo-p-MPES 的一些化學性質(zhì)如溶解性及底物本身的不穩(wěn)定性，其可選用的酶催化體系范圍比較窄，叔丁醇為其最佳催化體系。現(xiàn)有的許多商品脂肪酶對對甲砜基苯絲氨酸乙酯的催化效果也不甚理想，其中效果相對較好的脂肪酶為Novzyme 435。以Novzyme 435 脂肪酶為基礎(chǔ)，通過對不同因素的考察，確定了最優(yōu)反應條件:9.98 mL 脫水叔丁醇+20 μL Tris-HCl 緩沖液 (20 mmol，pH 值8.0);25 mg DL-threo-p-MPSE;20 mg Novzyme 435;160 r·min-1。在反應192 h 后，DL-threo-p-MPSE 的底物對映體過量百分數(shù)由最初試驗的35.13%上升到92.54%，所對應的底物轉(zhuǎn)化率為68.62%。然而，不足之處為反應的時間過長及一定量的D-threo-p-MPSE 的損失，勢必會影響反應效率。在后續(xù)的研究過程中，研究重點可以放在，在不影響酶的對映體選擇性及不增加副反應程度的前提下，探索添加不同類別的化學物質(zhì)以發(fā)掘出酶對于該獸藥中間體的潛在催化效能上。

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