易小利，鄭 雪，俞玲娟，張正波，裘娟萍

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

壯觀鏈霉菌 (Streptomyces spectabilis)屬于粉紅孢類群，氣生菌絲體為橙紅色。孢子絲直，有時(shí)呈假輪生，含10～50個(gè)孢子，孢子為橢圓形，表面光滑呈鮮紅色［1］。壯觀鏈霉菌是大觀霉素 (又稱奇放線菌素或壯觀菌素)的主要產(chǎn)生菌。大觀霉素具有廣譜的抗菌活性，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌及陰性菌均有較強(qiáng)的抑制能力［2］。

壯觀鏈霉菌菌株LXR1H-8 是經(jīng)基因組重排和傳統(tǒng)誘變獲得的菌株，其抑菌活性大大提高，尤其是抑菌組分對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的高效抑制，而對(duì)革蘭氏陰性菌如大腸桿菌的抑菌活性降低，與大觀霉素的抑菌譜不盡相同，因而推測(cè)改良后的壯觀鏈霉菌菌株LXR1H-8 的代謝產(chǎn)物發(fā)生了改變［3］。本試驗(yàn)?zāi)康脑谟诶蒙镒燥@影方法和TLC 方法跟蹤抑菌組分，多次使用硅膠柱層析分離樣品，獲得較好的分離效果。

在活性組分分離純化過(guò)程中常用的快速檢測(cè)方法為化學(xué)顯色法、紫外可見(jiàn)分光光度法和高效液相色譜法。由于試驗(yàn)初期沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照又不清楚其化學(xué)結(jié)構(gòu)，難以進(jìn)行定性和定量;若采用其他生物活性測(cè)定方法如濾紙片法，則需要大量的樣品，在達(dá)到有效活性跟蹤的目的時(shí)，也造成了活性組分的浪費(fèi)，對(duì)于一些分離過(guò)程復(fù)雜的工藝來(lái)說(shuō)，更是浪費(fèi)原料，也不利于一些微量成分的分離與純化［4］。本試驗(yàn)采用了生物活性檢測(cè)法和TLC 分析相結(jié)合的方法，達(dá)到高效抑菌組分的分離純化效果。

生物自顯影法的原理是將具有生物活性的組分，如抗生素等，在薄層層析或是紙層析上分離后，將分離開(kāi)的條帶 (硅膠粉末刮取或剪切或直接覆蓋)與有相當(dāng)指示菌的培養(yǎng)基表面接觸，在合適的溫度下經(jīng)過(guò)一定時(shí)間培養(yǎng)后，瓊脂表面出現(xiàn)抑菌點(diǎn)而得到定位。通過(guò)這種方法進(jìn)行活性檢測(cè)，一方面可以節(jié)約原料，達(dá)到活性跟蹤的目的，另一方面證實(shí)繼續(xù)分離純化可得到單一抑菌活性組分的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

壯觀鏈霉菌LXR1H-8，試驗(yàn)指示菌藤黃八疊球菌 (Sarcina lutea)，由浙江工業(yè)大學(xué)微生物試驗(yàn)室保存。

斜面培養(yǎng)基:牛肉膏2.5%，可溶性淀粉2.0%，K2HPO40.05%，MgSO40.05%，NaCl 0.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001%，pH 值7.2，121℃滅菌20 min。

菌絲體培養(yǎng)基:酵母膏0.4%，葡萄糖1.0%，蛋白胨 0.4%，MgSO4·7H2O 0.05%，KH2PO40.2%，K2HPO40.4%，pH 值7.0，115℃滅菌30 min。

鑒定培養(yǎng)基:蛋白胨6 g，酵母浸膏6 g，牛肉浸膏1.5 g，葡萄糖10 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 值7.8，115℃滅菌30 min。

1.2 壯觀鏈霉菌菌株培養(yǎng)

取活化后的斜面，以10% (V/V)的接種量接入搖瓶 (250 mL)種子培養(yǎng)基中，置于28℃，160 r·min-1旋轉(zhuǎn)式搖床中培養(yǎng)24 h。以10% (V/V)的接種量將上述種子液接入30 mL 菌體培養(yǎng)基中，置于28℃，160 r·min-1旋轉(zhuǎn)式搖床中培養(yǎng)120 h。

1.3 指示菌的培養(yǎng)及菌懸液的配制

取1 支新鮮藤黃鏈霉菌的斜面，用接種環(huán)挑取1 環(huán)在新的斜面培養(yǎng)基上劃線，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，備用。

使用時(shí)用已滅過(guò)菌的生理鹽水將菌苔洗下，并測(cè)定其在600 nm 下的吸光度，調(diào)整菌液濃度至D值為1.5，備用。

1.4 生物自顯影

在無(wú)菌條件下將制備好的藤黃八疊球菌菌懸液(D600=1.500，1 mL)加入到培養(yǎng)基中 (100 mL)，搖勻后傾注平皿，每個(gè)培養(yǎng)皿倒入培養(yǎng)基25 mL。待培養(yǎng)基凝固后，將已層析結(jié)束后展開(kāi)劑完全揮發(fā)的硅膠板取出，刮取相應(yīng)的條帶粉末置于培養(yǎng)基表面，并在硅膠粉末處放置牛津杯，向其中加入50 μL 的甲醇溶液，目的在于抑菌組分充分溶解并隨牛津杯均勻擴(kuò)散，形成規(guī)則的抑菌圈。蓋好平皿，將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.5 TLC 跟蹤抑菌組分

用鉛筆在已活化的硅膠板 (GF 254)下端1 cm 處劃一平行底邊的細(xì)線并等距離標(biāo)志點(diǎn)樣點(diǎn)。點(diǎn)樣采用0.3 mm 玻璃毛細(xì)管點(diǎn)樣，點(diǎn)樣直徑小于2 mm，展開(kāi)采用立式玻璃展開(kāi)槽。先向展開(kāi)槽中加入展開(kāi)劑，靜置30 min，使展開(kāi)槽內(nèi)部充滿飽和氣體，之后將硅膠板迅速放入，盡量不破壞展開(kāi)槽內(nèi)溶劑的飽和狀態(tài)，進(jìn)行線性上行展開(kāi)。層析結(jié)束時(shí)取出硅膠板，及時(shí)用鉛筆標(biāo)記溶劑前沿，吹干后254 nm 紫外透射儀下觀察展開(kāi)結(jié)果。

1.6 壯觀鏈霉菌發(fā)酵液中抑菌組分的粗提

取壯觀鏈霉菌的發(fā)酵液10 L，經(jīng)離心處理后，去除菌渣，加入適量的草酸除去Ca2+，離心，取上清液，用乙酸乙酯少量多次提取上清液，收集乙酸乙酯相，減壓蒸干濃縮，獲得棕色膏狀物即為壯觀鏈霉菌抑菌組分的粗提物。

1.7 粗提物的前處理

依次用MCI 柱層析和硅膠柱層析分離抑菌組分，收集洗脫液，采用TLC 方法，合并條帶相同的部分，收集洗脫液濃縮蒸干，獲得有效的抑菌組分C1(粗品)。

1.8 硅膠柱層析分離C1組分

1.8.1 展開(kāi)劑的選擇

用玻璃毛細(xì)點(diǎn)樣管吸取少量C1在硅膠板上點(diǎn)樣，選用氯仿-甲醇體系為20∶1，30∶1。依次展開(kāi)，選擇Rf=0.3～0.4 的展開(kāi)體系。254 nm 紫外顯色，觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.8.2 色譜條帶的抑菌活性跟蹤

選擇氯仿-甲醇體系 (30∶1)的展開(kāi)色譜條帶，將相應(yīng)的色譜條帶刮取下，分別用少許等量的甲醇溶解，檢測(cè)方法同1.4 節(jié)。

1.8.3 上樣洗脫

準(zhǔn)確稱取120 g 的硅膠干法裝柱，柱規(guī)格為5 cm×60 cm。將少量甲醇溶解的樣品C1(172 mg)加入硅膠拌樣，干法上樣，洗脫液氯仿-甲醇30∶1 (V/V)，洗脫流速約為4 mL·min-1，依次收集洗脫液，每管約12 mL，共收集40 管。TLC 分析收集的樣液，展開(kāi)劑為氯仿-甲醇30∶1 (V/V)。

1.8.4 硅膠柱層析分離C1x部分

準(zhǔn)確稱取120 g 的硅膠 (100～200 目)干法裝柱，柱規(guī)格為5 cm×60 cm，將少量甲醇溶解的樣品C1b(170 mg)加入硅膠拌樣，干法上樣，洗脫液石油醚-丙酮1∶1 (V/V)，洗脫流速約為4 mL·min-1，依次收集洗脫液，約每管12 mL，共收集80 管。TLC 分析收集的樣液，展開(kāi)劑選用石油醚-丙酮1∶1 (V/V)。

1.8.5 凝膠柱層析純化Cv部分

量取已預(yù)先處理好的凝膠樹(shù)脂HW-40C 300 mL，濕法裝柱，柱規(guī)格2.4 cm×70 cm。樣品Cv(20 mg)用少量的甲醇充分溶解，上柱吸附后再洗脫。洗脫液為分析純甲醇，洗脫流速 1 mL·min-1，收集洗脫液，每管10 mL，共收集80管。TLC 分析收集的樣液，展開(kāi)劑為石油醚-丙酮1∶1 (V/V)。254 nm 紫外顯色，觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.8.6 液質(zhì)聯(lián)用 (LC-MS)方法

液質(zhì)聯(lián)用適于成分復(fù)雜的代謝產(chǎn)物分析，其原理為以液相色譜做為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測(cè)系統(tǒng)。樣品在質(zhì)譜部分和流動(dòng)相分離，被離子化后，經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)量數(shù)分開(kāi)，經(jīng)檢測(cè)器得到質(zhì)譜圖。取目的組分Cv2少許，用甲醇稀釋置于液相瓶中，根據(jù)已建立的液相條件，分析保留時(shí)間為25.127 h 的液相峰，ESI 正源。

2 結(jié)果與分析

2.1 硅膠柱層析分離C1組分

2.1.1 洗脫劑的選擇

樣品C1分別在a，b 2 塊硅膠板上點(diǎn)樣，展開(kāi)體系為氯仿-甲醇，配比分別為20∶1 和30∶1。展開(kāi)結(jié)果如圖1 所示，目標(biāo)條帶已標(biāo)記 (藍(lán)色線圈)，其在a，b 2 塊板的Rf值分別為0.48 和0.35。選擇Rf=0.35 的展開(kāi)體系作為硅膠柱層析的洗脫條件。

2.1.2 活性跟蹤抑菌組分

樣品C1在硅膠板上點(diǎn)樣，展開(kāi)后顯色觀察，將3 條較為明顯的色譜帶刮取下，采用管碟法檢測(cè)3 條帶的抑菌活性。12 h 后觀察結(jié)果。如圖2 所示，1 和2 無(wú)抑菌活性，3 有抑菌活性，抑菌圈22.0 mm。試驗(yàn)結(jié)果顯示，1 和2 色譜條帶為雜質(zhì)，3 為目標(biāo)組分。

圖1 λmax254 nm 下C1活性組分在氯仿-甲醇體系中的層析

圖2 色譜條帶抑菌活性跟蹤結(jié)果

2.1.3 上樣洗脫

收集40 管洗脫液，每隔1 管洗脫液硅膠板上點(diǎn)樣，展開(kāi)后，紫外顯色。如圖3 所示，目標(biāo)組分主要集中在17～23 管，但是目的條帶 (藍(lán)色線框標(biāo)記)與雜帶 (綠色線框標(biāo)記)并未分開(kāi)，展開(kāi)劑為氯仿-甲醇 (30∶1)體系不適于上樣洗脫。故合并洗脫液17～23 管 (C1x)，減壓濃縮蒸干，獲得C1x50 mg，用于下步的分離純化。

圖3 洗脫液1～35 管紫外 (λ254nm)顯色結(jié)果

2.2 硅膠柱層析分離C1x部分

收集80 管洗脫液，自第11 管洗脫液開(kāi)始，每隔1 管點(diǎn)樣，薄層層析后進(jìn)行紫外觀察。如圖4 所示，11～19 管主要是雜帶，23～69 管是目的條帶。故根據(jù)TLC 分析，可合并Rf值相同的部分。即真空減壓濃縮23～69 管 (Cv)，蒸干獲得20 mg。

2.3 凝膠柱層析純化Cv部分

如圖5 所示，收集40 管洗脫液，每隔1 管點(diǎn)樣，展開(kāi)顯色后，23～33 管目的條帶清晰，條帶比較純。故合并23～33 管，減壓濃縮蒸干后獲得Cv23.00 mg。且這部分的組分比較純，基本是單一組分。

2.4 液質(zhì)聯(lián)用

2.4.1 樣品Cv2的液相分析方法建立

利用分光光度計(jì)對(duì)樣品Cv2(yxl-2)全波段掃描，波長(zhǎng)為200～800 nm，結(jié)果顯示最大光吸收值λmax=254 nm。樣品在甲醇中溶解度較好，流動(dòng)相選擇甲醇-水體系，故液相條件設(shè)定為ZORBAX Eclipse XDB-C18 (5 μm，4.6 mm×250 mm)，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，流動(dòng)相為甲醇∶水=40∶60～90∶10(V/V)，0～ 60 min梯度洗脫，流速0.8 mL·min-1，柱溫30℃，進(jìn)樣量為20 μL (圖6)。

圖4 洗脫液11～79 管的紫外 (λ254nm)顯色結(jié)果

圖5 洗脫液1～40 管紫外 (λ254nm)顯色結(jié)果

圖6 樣品Cv2的液相分析圖譜

2.4.2 樣品CV2的質(zhì)譜

如圖7 所示，保留時(shí)間為25.127 h，樣品CV2的分子量為1 448，與壯觀鏈霉菌的代謝產(chǎn)物大觀霉素、巴佛羅霉素A1(bafilomycin A1)、硝苯吡喃酮(nitrophenyl pyrone)、曲張鏈絲菌素(streptovaricin)、間環(huán)丙菌素(metacycloprodigiosin)、spectomycin 和壯觀鏈菌素 (spectinabilin)等分子量均不相同，因此可推測(cè)是一種新的抑菌組分，樣品CV2的化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定還需借助其他圖譜的分析。

圖7 t=25.127 h，CV2的質(zhì)譜

3 小結(jié)和討論

采用生物自顯影和TLC 相結(jié)合的方法跟蹤壯觀鏈霉菌發(fā)酵液中的抑菌組分非常明確且簡(jiǎn)便，測(cè)定結(jié)果不受雜質(zhì)的影響。TLC 是被分離物質(zhì)即樣品、吸附劑和展開(kāi)劑共同作用的結(jié)果，因此選擇與樣品及吸附劑相匹配的展開(kāi)劑是分離效果好壞的關(guān)鍵。

本試驗(yàn)過(guò)程中多次采用了硅膠柱層析分離技術(shù)，該技術(shù)分離提取效果較好。采用硅膠柱層析分離技術(shù)需要注意一下幾點(diǎn):首先是裝柱。試驗(yàn)選擇干法裝柱，將吸附劑通過(guò)漏斗倒入柱內(nèi)，同時(shí)用橡皮槌輕輕敲打色譜柱，使裝填均勻。柱裝填好后，打開(kāi)下端活塞，連接真空泵的一端，抽去柱內(nèi)填料間的空氣，使填料壓實(shí)。其次是加樣。在進(jìn)行柱色譜操作時(shí)，被分離的樣品用少許甲醇充分溶解，加入適量的粗硅膠充分吸附，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器里于45℃的條件下蒸干，將樣品均勻置于柱頂，盡量使樣品帶均勻平整，在樣品面上塞入脫脂棉，以防加入洗脫劑時(shí)破壞樣品帶。第三是洗脫劑的選擇。另外，薄層層析選擇的展開(kāi)劑作為硅膠柱層析動(dòng)態(tài)洗脫時(shí)的洗脫劑，有可能不合適，試驗(yàn)過(guò)程中需要根據(jù)具體情況重新選擇洗脫體系。作為展開(kāi)劑的選擇應(yīng)盡可能從以3 方面考慮:毒性小，沸點(diǎn)適中，粘度小。最后，熟悉常用的洗脫體系方面的基礎(chǔ)知識(shí)，如氯仿-甲醇體系，石油醚-丙酮體系等。

［1］金燕華，裘娟萍，何景昌，等.壯觀鏈霉菌產(chǎn)生抗生素的多樣性［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)工業(yè)雜志，2006，37 (12):849-854.

［2］奧格雷迪著，李繼光主譯.抗生素及化學(xué)藥物治療［M］.沈陽(yáng):遼寧出版社，2002.

［3］夏云重.基因組重排與傳統(tǒng)育種相結(jié)合選育大觀霉素高產(chǎn)菌株［D］.杭州.浙江工業(yè)大學(xué)，2009.

［4］張緒敏.抗菌素微生物效價(jià)測(cè)定法［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1963.