曹洪慶 黃鶴光 陳燕昌 李洪森

·論著·

烏司他丁對急性壞死性胰腺炎大鼠腸黏膜屏障的保護作用

曹洪慶 黃鶴光 陳燕昌 李洪森

目的觀察烏司他丁干預急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠后血TNF-α、二胺氧化酶(DAO)及腸黏膜組織緊密連接蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)表達水平的變化，探討其可能機制。方法按完全隨機法將SD雄性大鼠隨機分為假手術(shù)組、ANP組及烏司他丁組。采用5%?；悄懰徕c逆行注入膽胰管的方法制模。制模后6、24 h取血檢測TNF-α、DAO活性，胰腺及回腸組織常規(guī)病理檢查，RT-PCR及免疫組化法檢測回腸組織ZO-1 mRNA及蛋白的表達。結(jié)果術(shù)后6 h，ANP組胰腺大片壞死，大量炎細胞浸潤；回腸黏膜絨毛上皮壞死、血管出血、炎細胞浸潤。烏司他丁組的胰腺及回腸組織損傷較ANP組減輕。假手術(shù)組、ANP組、烏司他丁組術(shù)后6 h的血TNF-α水平分別為(10.83±0.96)、(181.89±4.93)、(128.23±2.40)ng/L；DAO活性分別為(354.79±3.67)、(117.21±5.58)、(282.98±9.12) U/L；回腸組織ZO-1蛋白表達量分別為(10.00±1.87)、(1.20±0.84)、(5.80±2.86)分；ZO-1 mRNA表達量為0.878±0.015、0.466±0.023、0.778±0.033。ANP組血TNF-α水平較假手術(shù)組明顯升高， DAO活性、回腸組織ZO-1 mRNA及蛋白表達較對照組明顯降低(P值均<0.05)；烏司他丁組的血TNF-α水平較ANP組降低，DAO活性、回腸組織ZO-1 mRNA及蛋白表達較ANP組明顯升高(P值均<0.05)。結(jié)論烏司他丁可能通過抑制TNF-α的過度釋放、提高血漿中DAO活性，從而上調(diào)回腸組織中ZO-1 mRNA和蛋白表達，進而保護腸黏膜屏障。

胰腺炎，急性壞死性； 烏司他??； 大鼠； 緊密連接蛋白-1； 腸黏膜屏障

重癥急性胰腺炎(SAP)急性期發(fā)作時全身炎癥細胞被過度激活并大量釋放細胞因子[1]。細胞因子及內(nèi)毒素的產(chǎn)生可造成機體毛細血管滲漏，腸黏膜組織水腫、缺血壞死，緊密連接蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)被破壞，從而引起腸屏障功能障礙，導致腸道細菌易位、內(nèi)毒素進入循環(huán)，誘發(fā)和加重全身炎癥反應綜合征(SIRS)、多器官功能障礙綜合征(MODS)。因此研究SAP時腸道屏障損傷的可能機制意義重大。本實驗應用烏司他丁干預急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠，旨在觀察其對腸黏膜屏障的保護作用，探討可能的機制，為臨床治療提供實驗依據(jù)。

材料和方法

一、實驗動物及分組

清潔級雄性SD大鼠60只，體重200～220 g，購自上海斯萊克實驗動物公司。按完全隨機法分為假手術(shù)組、ANP組和烏司他丁組，各20只。參照楊波等[2]方法，采用5%?；悄懰徕c(0.1 ml/100 g體重)逆行注入胰膽管制備ANP模型。烏司他丁組于造模后5 min，在左后肢股靜脈置管，連接微量注射泵以1000 IU/100 g體重劑量注入烏司他丁，約10 min內(nèi)注射完畢。假手術(shù)組大鼠開腹后僅翻動胰腺即關腹。假手術(shù)組和ANP組大鼠于術(shù)后5 min由左后肢股靜脈注入等容積生理鹽水。造模后6、24 h經(jīng)門靜脈置管采血3～4 ml，切取胰腺組織2 cm×1 cm×0.2 cm及距回盲部5 cm處的回腸組織2 cm×0.5 cm×0.2 cm。

二、血清TNF-α及血漿二胺氧化酶(DAO)檢測

取血后，部分分離血清，部分血注入盛有2%消炎痛-EDTA液的試管。搖勻后均經(jīng)4℃ 3000 r/min離心15 min，采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法分別檢測TNF-α及DAO含量，按試劑盒(美國RD公司)說明書操作。

三、胰腺組織、回腸組織病理學檢查

取胰腺及部分回腸組織常規(guī)固定、石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察病理改變。

四、回腸組織ZO-1蛋白檢測

應用免疫組化方法，按PV-6001通用型二步法檢測試劑盒(北京中杉金橋公司)說明書操作。兔抗大鼠ZO-1一抗(北京博奧森公司)工作濃度1∶100，最后DAB顯色5 min。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照，已知陽性回腸組織為陽性對照。胞質(zhì)及少量胞核出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為染色陽性。每張切片高倍鏡下隨機選取5個視野觀察，并參照文獻[2]結(jié)合陽性細胞百分比及陽性細胞染色強弱兩個方面評分：無陽性細胞為0分，陽性細胞占1%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～80%為3分，81%～100%為4分；染色陰性為0分，弱陽性為1分，中度陽性為2分，強陽性為3分。兩分值乘積為該例組織的免疫組化評分(IHCS)。觀察5張切片，取均數(shù)。

五、回腸組織ZO-1 mRNA檢測

采用RT-PCR半定量分析。取凍存的回腸組織，用Trizol提取組織總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO公司)逆轉(zhuǎn)錄cDNA后，進行PCR擴增。引物序列：ZO-1上游5′-CTCGGGCATTATTCGCCTTC-3′，下游5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，片段長度205 bp；內(nèi)參β-actin上游5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游 5′-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3′，片段長度457 bp。PCR反應條件：94 ℃5 min； 94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像分析儀檢測，以ZO-1 mRNA與β-actin mRNA擴增片段灰度比值表示ZO-1 mRNA表達量。

六、統(tǒng)計學方法

結(jié) 果

一、動物存活情況

假手術(shù)組大鼠無死亡；ANP組大鼠6 h內(nèi)死亡1只，24 h內(nèi)死亡2只，死亡率為15%(3/20)；烏司他丁組大鼠24 h內(nèi)死亡1只，死亡率為5%(1/20)。

二、血TNF-α、DAO活性變化

ANP組血清TNF-α水平明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)；而血漿DAO活性明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)。烏司他丁組血清TNF-α水平較ANP組明顯降低，但仍顯著高于假手術(shù)組(P值均<0.05)；血漿DAO活性較ANP組明顯升高，但仍明顯低于假手術(shù)組(P值均<0.05，表1)。

組 別只數(shù)TNF?α水平(ng/L)6h24hDAO活性(U/L)6h24h假手術(shù)組2010．83±0．969．89±0．14354．79±3．67313．36±4．43ANP組 20181．89±4．93a198．89±4．83a117．21±5．58a91．18±1．09a烏司他丁組20128．23±2．40ab106．79±3．30ab282．98±9．12ab234．11±8．89ab

注：與假手術(shù)組比較，q值為4.25、4.41、4.36、4.27、3.86、3.74、3.34、3.38，aP<0.05；與ANP組比較，q值為3.27、3.36、3.21、3.65，bP<0.05

三、胰腺和回腸組織病理學改變

假手術(shù)組胰腺及回腸組織無明顯異常。ANP組大鼠腹腔內(nèi)見大量血性腹水，大網(wǎng)膜、腸系膜上可見皂化斑，胰腺腫大，鏡下見胰腺大片壞死，大量炎性細胞浸潤；回腸黏膜絨毛上皮壞死脫落，血管充血擴張，大量中性粒細胞浸潤。烏司他丁組大鼠腹腔內(nèi)血性腹水、大網(wǎng)膜及腸系膜上皂化斑明顯減少，胰腺輕度腫大，鏡下見胰腺壞死灶、血管破裂出血明顯減輕，少量炎細胞浸潤；回腸組織壞死、血管破裂出血、炎細胞浸潤不明顯(圖1)。

圖1假手術(shù)組(a)、ANP組(b)和烏司他丁組(c) 6 h時大鼠胰腺(上)及回腸(下)組織病理學改變(HE ×200)

四、回腸組織ZO-1 mRNA和蛋白表達的變化

假手術(shù)組ZO-1蛋白均勻一致地分布于小腸上皮細胞連接處的尖端，呈蜂巢狀；ANP組ZO-1蛋白分布不均，染色變淺，IHCS明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)；烏司他丁組ZO-1蛋白分布趨向較ANP組均勻，IHCS明顯高于ANP組，但仍明顯低于假手術(shù)組(P值均<0.05，圖2，表2)。

圖2假手術(shù)組(a)、ANP組(b)和烏司他丁組(c)6 h時大鼠回腸組織ZO-1蛋白表達(免疫組化 ×200)

ANP組ZO-1 mRNA表達較假手術(shù)組明顯減少(P<0.05)；烏司他丁組ZO-1 mRNA表達較ANP組明顯增強，但仍顯著低于假手術(shù)組(P值均<0.05，圖3，表2)。

M:Marker；1～2：假手術(shù)組；3～4：ANP組；5～6：烏司他丁組

組 別只數(shù)ZO?1蛋白表達(IHCS)6h24hZO?1mRNA表達6h24h假手術(shù)組2010．00±1．878．60±2．190．878±0．0150．830±0．024ANP組201．20±0．84a0．80±0．84a0．466±0．023a0．550±0．027a烏司他丁組205．80±2．86ab2．40±1．14ab0．778±0．033ab0．704±0．011ab

注： 與假手術(shù)組比較，q值為4.40、4.36、4.36、4.05、3.82、4.21、4.27、3.51，aP<0.05；與ANP組比較，q值為3.86、3.24、4.27、3.51，bP<0.05

討 論

傳統(tǒng)治療SAP的重點圍繞著“抑制胰腺分泌，抑制胰蛋白酶活性和補充抗蛋白酶等方面”展開。近年來，隨著對SAP時MODS、細菌易位、腸源性感染等的深入研究，腸道屏障功能逐漸被人們所重視。腸黏膜屏障一般由機械屏障、免疫屏障、化學屏障和生物屏障4部分組成[3]。其中與腸黏膜通透性關系最為密切的是機械屏障。它由腸黏膜表面的黏液層、腸上皮細胞本身及其緊密連接、上皮基底膜、黏膜下固有層等組成。緊密連接對維持腸黏膜上皮屏障功能的完整性有重要作用，能有效地阻止腸腔內(nèi)細菌、毒素、炎性介質(zhì)等易位[4]。緊密連接由多種蛋白組成[5]，包括ZOs、occludin、Claudin等結(jié)構(gòu)蛋白[6-7]和肌動蛋白、肌球蛋白、E鈣粘素等調(diào)節(jié)蛋白。ZO-1常被用來作為觀察各種組織緊密連接屏障功能和通透性功能的指標，有研究[8-9]發(fā)現(xiàn)，TNF-α可激活上皮細胞間的肌球蛋白輕鏈激酶，調(diào)整緊密連接蛋白Occludin和ZO-1在緊密連接膜微區(qū)的分布，造成緊密連接處功能障礙，引起黏膜通透性增加。

DAO是特異性存在于人類和所有哺乳動物腸黏膜上皮細胞胞質(zhì)中具有高度活性的細胞內(nèi)酶，其在小腸黏膜上皮層絨毛中含量高、活性強。正常情況下血漿中檢測不到DAO。當腸黏膜上皮細胞受損、壞死后，DAO釋放進入細胞間隙、淋巴管和血循環(huán)，或隨壞死脫落的腸黏膜細胞進入腸腔，導致血漿和腸腔DAO活性增高。外周血中DAO活性穩(wěn)定，是反映腸道黏膜上皮細胞完整性的血漿標志物[10]。

本實驗顯示，ANP大鼠的血TNF-α含量較假手術(shù)組明顯升高，DAO活性較假手術(shù)組明顯下降，腸黏膜壞死，腸黏膜組織ZO-1 mRNA和蛋白表達明顯下降，表明制模后TNF-α等細胞因子大量釋放及微循環(huán)灌注不足，導致腸黏膜上皮細胞壞死，ZO-1 mRNA和蛋白表達減少，腸黏膜屏障被破壞。

烏司他丁是從人尿中分離純化出的一種糖蛋白[11]，分子量約為67000，經(jīng)國內(nèi)外學者研究證實其具有抑制蛋白水解酶、糖類和脂類水解酶的活性；穩(wěn)定溶酶體膜，抑制溶酶體的釋放；抑制炎癥介質(zhì)和細胞因子的釋放等作用。本實驗結(jié)果顯示，烏司他丁干預ANP大鼠后，血TNF-α含量降低，DAO活性升高，腸黏膜壞死減輕，腸黏膜組織ZO-1 mRNA和蛋白表達增加，表明烏司他丁對ANP時的腸道屏障損傷起到保護作用。

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Protectivemechanismofulinastatinonmucosalbarrierinratswithacutenecrotizingpancreatitis

CAOHong-qing,HUANGHe-guang,CHENYan-chang,LIHong-sen.
DepartmentofGeneralSurgery,UnionHospital,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China

HUANGHe-guang,Email:hhuang2@yahoo.com.cn

ObjectiveTo study the changes of serum levels of tumor necrosis factor-α(TNF-α), diamine oxidase (DAO), the expression of tight junction protein-1 (zonula occludens 1, ZO 1) in acute necrotizing pancreatitis (ANP) rats after ulinastatin intervention.MethodsSD male rats were randomly divided into sham operation (SO) group, ANP group and ulinastatin treatment group. ANP model was induced by injecting 5% sodium taurocholate into biliary and pancreatic duct. The rats were sacrificed at 6 and 24 hours, and then the levels of TNF-α, DAO and pathology change in pancreatic and intestinal were determined. The expression of bowel mucosa ZO-1 mRNA and protein was detected by RT-PCR and immunohistochemistry.ResultsSix hours after ANP induction, massive pancreatic necrosis and inflammatory cells infiltration were present, while epithelium necrosis of villi in ileum, vessel hemorrhage and inflammatory cells infiltration was found. The pathologic injury of pancreas and ileum in ulinastatin group was reduced when compared with that in ANP group. The serum levels of TNF-α were (10.83±0.96), (181.89±4.93), (128.23±2.40)ng/L in SO group, ANP group and ulinastatin group; and the activities of DAO were (354.79±3.67),(117.21±5.58),(282.98±9.12)U/L; the expressions of ZO 1 protein were 10.00±1.87, 1.20±0.84, 5.80±2.86; and the expressions of ZO 1 mRNA were 0.878±0.015,0.466±0.023, 0.778±0.033. The serum level of TNF-α in ANP group was significantly higher than that in SO group, while the activities of DAO, expressions of ZO 1 mRNA and protein in ileum were significantly lower than that in SO group (P<0.05). The serum level of TNF-α in ulinastatin group was significantly lower than that in ANP group, while the activities of DAO, expressions of ZO 1 mRNA and protein in ileum were significantly higher than that in ANP group (P<0.05).ConclusionsUlinastatin may inhibit the over release of TNF-α and improve plasma DAO activity, then increase the expression of ZO-1 mRNA and protein, thus protect the intestinal mucosa barrier.

Pancreatitis, acute necroting； Ulinastatin； Rat； Zonula occludens-1； Intestinal mucosal barrier

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.01.014

福建省自然科學基金(2008J0086)；黎介壽院士腸道屏障研究專項基金；天普研究基金(01200915)

350001 福州，福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院普外科

黃鶴光，Email:hhuang2@yahoo.com.cn

2011-04-27)

(本文編輯：屠振興)