王念林 張鐵英 歐陽(yáng)玉霞 楊元生 陳墾

·短篇論著·

清胰湯對(duì)急性胰腺炎大鼠胰腺NF-κB p65表達(dá)的影響

王念林 張鐵英 歐陽(yáng)玉霞 楊元生 陳墾

急性胰腺炎(AP)為臨床常見(jiàn)病，病情兇險(xiǎn)，常引起全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，并最終導(dǎo)致多器官功能衰竭(MODS)。目前具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，治療仍以對(duì)癥支持為主。因而探求AP發(fā)病機(jī)制對(duì)尋找有效的治療方法意義重大。本研究觀察清胰湯對(duì)AP大鼠胰腺NF-κB p65表達(dá)的影響。

一、材料與方法

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：54只SD大鼠由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(粵)2008-0002，雌雄不限，體重(200±10)g。按完全隨機(jī)法分成對(duì)照組、AP組、清胰湯組。采用逆行胰膽管注射3%?；悄懰徕c的方法[1]建立AP模型。清胰湯組于建模后立刻予清胰湯1 ml/100 g體重灌胃，每12 h給藥一次；對(duì)照組僅開(kāi)腹翻動(dòng)胰腺數(shù)次即關(guān)腹，以生理鹽水替代灌胃。

2．血清淀粉酶、IL-1和TNF-α測(cè)定：血清淀粉酶測(cè)定采用人工碘比色法；血清IL-1和TNF-α檢測(cè)采用ELISA方法。

3．胰腺病理學(xué)檢查及NF-κB p65檢測(cè)：胰腺組織常規(guī)病理檢查，盲法閱片，并根據(jù)Ozhan等[2]標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分。胞質(zhì)和(或)胞核呈黃色或棕黃色為陽(yáng)性。高倍鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比及染色強(qiáng)度。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：<5% 0分，6%～25% 1分，26%～50% 2分，51%～75% 3分，>75% 4分；無(wú)染色0分，淺黃色1分，黃色2分，棕黃色3分。兩評(píng)分乘積0～1分為(-)，2～3分(+)，4～5分(++)，>6分(+++)。

二、結(jié)果

1．血清淀粉酶、IL-1和TNF-α水平： AP組和清胰湯組血清淀粉酶、IL-1和TNF-α水平均高于對(duì)照組；AP組血清淀粉酶水平于24 h達(dá)到峰值，隨后逐漸下降，予清胰湯治療后，24 h和48 h血清淀粉酶明顯降低，72 h后3組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；清胰湯組血清IL-1和TNF-α較AP組明顯降低，呈時(shí)效依賴性，以72 h下降最明顯(表1)。

表1 各組血清淀粉酶、IL-1和TNF-α變化

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與AP組比較，bP<0.05

2．胰腺病理組織學(xué)變化：對(duì)照組胰腺組織未見(jiàn)病理改變(圖1a)；AP組大鼠胰腺可見(jiàn)出血、壞死，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，腺泡結(jié)構(gòu)模糊，部分腺泡胞核溶解或消失，殘余腺泡腫脹，間質(zhì)水腫(圖1b)；而清胰湯組胰腺組織病理改變較AP組減輕(圖1c)。各組胰腺病理評(píng)分見(jiàn)表2。

圖1對(duì)照組(a)、AP組(b)和清胰湯組(c)大鼠胰腺組織病理改變(HE ×200)

表2 各組胰腺病理評(píng)分

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與AP組比較，bP<0.05

3．胰腺NF-κB p65蛋白表達(dá)：對(duì)照組胰腺組織NF-κB p65微量表達(dá)，主要見(jiàn)于細(xì)胞質(zhì)，呈淺黃色(圖2a)；AP組各時(shí)間點(diǎn)NF-κB p65表達(dá)增強(qiáng)，呈棕黃色，部分細(xì)胞核也有表達(dá)(圖2b)；清胰湯組胰腺腺泡染色較AP變淺，胰腺NF-κB p65免疫組化積分較AP明顯降低(圖2c，表3)。

圖2 對(duì)照組(a)、AP組(b)和清胰湯組(c)胰腺NF-κB表達(dá)(×200)

表3 各組胰腺NF-κB p65免疫組化積分

注：與AP組比較，aP<0.05

討論AP病程中氧自由基、白介素、TNF等細(xì)胞因子大量產(chǎn)生，并易導(dǎo)致SIRS和MODS。清胰湯為傳統(tǒng)組方，具有通里攻下，減少腸源性感染與內(nèi)毒素血癥；活血化瘀，改善微循環(huán)，減輕各器官的缺血、缺氧，減少氧自由基的產(chǎn)生；清除氧自由基；抑制體內(nèi)各種炎癥因子的產(chǎn)生；誘導(dǎo)器官細(xì)胞凋亡，從而減輕器官壞死程度等作用[3]。本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用清胰湯治療后AP大鼠各種氧化應(yīng)激因子、炎癥因子明顯降低，器官損傷程度改善。

研究發(fā)現(xiàn)[4]，TNF-α、IL-1等多種細(xì)胞因子及黏附分子在基因多肽水平上受到NF-κB p65調(diào)節(jié)。活化的NF-κB p65可單獨(dú)或與其他轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同參與上述炎癥因子基因的誘導(dǎo)表達(dá)，在細(xì)胞因子瀑布樣級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起中心作用。在AP發(fā)生早期，多個(gè)器官可檢測(cè)到NF-κB p65高表達(dá)，并參與多器官的病理?yè)p傷[5]。應(yīng)用NF-κB p65活化選擇性抑制劑NBD，可選擇性靶向抑制NF-κB，明顯減輕AP大鼠胰腺、肺等器官損傷[6]。近年研究發(fā)現(xiàn)[7-8]，活性氧ROS是激活NF-κB的重要中介分子，因此抗氧化劑作為NF-κB抑制劑被深入研究。

本實(shí)驗(yàn)再次驗(yàn)證了清胰湯在AP模型大鼠中顯示出良好的治療效果。與AP組比較，清胰湯24 h和48 h血清淀粉酶明顯降低，72 h接近正常水平，提示清胰湯能有效降低血清淀粉酶。炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1在AP發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，本研究發(fā)現(xiàn)二者升高明顯。應(yīng)用清胰湯治療后大鼠血清TNF-α、IL-1水平于48 h和72 h較AP組下降明顯，提示清胰湯可抑制炎癥反應(yīng)，減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放。本結(jié)果顯示，AP大鼠胰腺NF-κB p65表達(dá)在建模后有不同程度升高，與血清中TNF-α、IL-1升高及胰腺病理?yè)p傷相平行，應(yīng)用清胰湯灌胃治療，降低了血清TNF-α、IL-1水平，并下調(diào)胰腺NF-κB p65的表達(dá)，改善其病理?yè)p傷。

綜上所述，中藥清胰湯對(duì)AP的治療是通過(guò)多靶點(diǎn)作用實(shí)現(xiàn)的 ，其可能機(jī)制是通過(guò)抑制炎癥通路中炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而達(dá)到保護(hù)器官目的。本研究得出，AP發(fā)生、發(fā)展涉及NF-κB p65等炎癥相關(guān)因子的激活，產(chǎn)生并釋放過(guò)度炎癥介質(zhì)介導(dǎo)過(guò)度炎癥反應(yīng)造成各器官的損傷；清胰湯可抑制AP大鼠體內(nèi)過(guò)度炎癥反應(yīng)，降低TNF-α、IL-1水平，下調(diào)胰腺NF-κB p65表達(dá)，從而起到保護(hù)胰腺的治療效果。

[1] 王念林，陳墾，龍友明，等.核因子-κB在大鼠急性壞死性胰腺炎中作用的實(shí)驗(yàn)研究.胰腺病學(xué)，2005,5：93-96.

[2] Ozhan G, Yanar HT, Ertekin C, et al. Polymorphisms in tumour necrosis factor alpha (TNFalpha) gene in patients with acute pancreatitis. Mediators Inflamm, 2010, 2010:482950.

[3] Yang DY, Duan SB, Aili JT. Effect of qingyi decoction in treating severe acute pancreatitis and its impacts on blood level of tumor necrosis factor-alpha, interleukin-6 and interleukin-8. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi,2009, 29:1122-1124.

[4] Viterbo D, Bluth MH, Mueller CM, et al. Mutational characterization of pancreatitis-assiociated protein 2 domains involved in mediating cytokine secretion in macrophages and the NF-kappaB pathway. J Immunol, 2008, 181:1959-1968.

[5] Wang YL, Zheng YJ, Zhang ZP, et al. Effects of gut barrier dysfunction and NF-kappaB activation on aggravating mechanism of severe acute pancteatitis. J Dig Dis, 2009,10:30-40.

[6] Long YM, Chen K, Liu XJ, et al. Cell-permeable Tat-NBD peptide attenuates rat pancreatitis and acinus cell inflammation response. World J Gastroenterol, 2009, 15:561-569.

[7] KanSH,Huang F,Tang J,et al.role of intrapulmonary expression of inducible Nitric oxide synthase gene and nuclear factor kappaB activation in severe pancreatitis-assosiated lung injury. Inflammation,2010,33:287-294.

[8] Szabolcs A, Biczó G,Rakonczay Z, et al.simultaneous proteosome inhibition and heat shock protein induction by bortezomib is beneficial experimental pancreatitis. Eur J Pharmacol,2009,616:270-274.

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.01.019

2010年廣州市花都區(qū)醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目(HD10WSY17)

510800 廣東廣州，廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科(王念林、張鐵英、歐陽(yáng)玉霞)；廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科(楊元生、陳墾)

陳墾Email:chken@gdpc.edu.cn

2011-02-22)

(本文編輯：屠振興)