李宏宇 李建軍 劉旭 吳春燕 趙佳鈞 陳延志 郭曉鐘

·論著·

外源性PTEN對胰腺癌細胞ASPC-1增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的影響

李宏宇 李建軍 劉旭 吳春燕 趙佳鈞 陳延志 郭曉鐘

目的研究第10染色體同源丟失性磷酸酶-張力蛋白基因(PTEN)對胰腺癌細胞系ASPC-1細胞周期、細胞增殖、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和表皮生長因子受體(EGFR)蛋白表達、裸鼠成瘤及轉(zhuǎn)移能力的影響。方法將含PTEN基因的質(zhì)粒pE-PTEN轉(zhuǎn)染ASPC-1細胞，以空質(zhì)粒pE轉(zhuǎn)染為對照，分別獲得ASPC-1-pE-PTEN(A-pE-P)細胞及ASPC-1-pE(A-pE)細胞。應用RT-PCR檢測細胞PTEN mRNA表達；免疫細胞化學法檢測PTEN、VEGF、EGFR蛋白表達；克隆形成實驗觀察克隆形成數(shù)；Transwell小室觀察細胞侵襲能力；裸鼠皮下注射癌細胞法觀察成瘤情況。結(jié)果與ASPC-1細胞比較，A-pE-P細胞的PTEN mRNA表達增加179.3%，PTEN蛋白表達明顯增加;VEGF蛋白表達明顯減少；EGFR蛋白表達無明顯變化；G2/M期細胞數(shù)明顯增加[(31.5±1.76)%比(26.81±1.03)%，P<0.05]；克隆形成數(shù)降低[(24.0±3.9)比(33.3±3.4)，F(xiàn)=4.283，P<0.01]，克隆形成率降低28%；穿膜細胞數(shù)明顯減少[每高倍視野(46.3±6.6)比(63.8±7.5)個，F(xiàn)=2.476，P<0.05];種植瘤體積明顯縮小[(142.4±30.9)比(202.7±43.6)mm3，t=4.834，P<0.01]，抑瘤率達42.4%；遠處轉(zhuǎn)移灶明顯減少[(2.0±0.7)比(5.0±1.3)個，t=0.451，P<0.01]。結(jié)論PTEN基因轉(zhuǎn)染后ASPC-1細胞VEGF表達減少，細胞生長被阻滯在G2/M期，增殖及轉(zhuǎn)移被抑制。

胰腺腫瘤； 基因，腫瘤抑制； 轉(zhuǎn)染； 第10染色體同源丟失性磷酸酶-張力蛋白基因

第10染色體同源丟失性磷酸酶-張力蛋白基因(phosphatase and tensinhomology deleted on chromo-some ten, PTEN)位于人10號染色體q23.3區(qū)。目前研究認為，PTEN可以通過磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信號轉(zhuǎn)導通路抑制腫瘤細胞增殖，但尚不多見。本研究觀察PTEN基因轉(zhuǎn)染胰腺癌細胞系ASPC-1后對細胞血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和表皮生長因子受體(EGFR)蛋白表達，細胞周期、克隆形成，裸鼠種植瘤形成及轉(zhuǎn)移的影響。

材料與方法

一、細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

人胰腺癌細胞系ASPC-1、pEAK8-PTEN及pEAK8質(zhì)粒由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院消化內(nèi)科提供。使用DOTAP脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(保靈曼公司)將pEAK8-PTEN和pEAK8分別轉(zhuǎn)染ASPC-1細胞。應用嘌呤霉素(1 mg/L，Gibco公司)篩選轉(zhuǎn)染細胞30 d，挑選陽性細胞克隆，擴增培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后的細胞分別命名為ASPC-1-pEAK8-PTEN(A-pE-P)和ASPC-1-pEAK8(A-pE)細胞。

二、方法

1．RT-PCR：應用TriPure試劑(Roche公司)提取各組細胞總RNA。應用RT-PCR方法檢測細胞PTEN mRNA的表達，試劑盒購自日本Takara公司。序列：PTEN正義5′-CATTATGACACCGCCAAA-3′,反義5′-TTGCCCCGATGTAATAAA-3′，產(chǎn)物209 bp；β-actin正義5′-ACACTGTGCCCATCTACGAGG-3′,反義5′-CTTTGCGGATGTCCACGTC-3′，產(chǎn)物381 bp，引物由上海生工公司合成。PCR條件：94℃ 4 min， 94℃ 30 s、56℃ 40 s、72℃ 40 s，30次循環(huán)，72℃ 5 min。產(chǎn)物經(jīng)電泳分離、掃描，以PTEN與β-actin條帶灰度比值表示mRNA相對表達量。

2．免疫細胞化學法：細胞行爬片培養(yǎng)，應用PV9000二步法免疫組化試劑盒(北京中山生物技術有限公司)檢測細胞PTEN、VEGF和EGFR蛋白的表達。鼠抗人VEGF、PTEN抗體購自Santa Cruz公司，鼠抗人EGFR單抗購自福州邁新生物公司。

3．細胞周期檢測：取各組細胞，PBS洗滌后，-20℃乙醇4℃固定，加入核糖核酸酶及碘化丙啶染色，上FACScan流式細胞儀，用488 nm激發(fā)光測細胞周期。設3個平行樣，重復一次，取均值。

4．細胞克隆形成率：取各組細胞，逐級稀釋后接種于培養(yǎng)皿，常規(guī)培養(yǎng)14 d，乙醇固定，結(jié)晶紫染色，計數(shù)細胞克隆≥50個細胞，計算克隆形成率(PE)。PE=克隆形成數(shù)/接種細胞數(shù)。

5．Transwell小室侵襲實驗：將各組細胞分別加入Transwell小室上層，下層加600 μl含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基及作為趨化因子的HGF，常規(guī)培養(yǎng)16 h，取出濾膜，擦去上層面細胞，中性甲醛固定，蘇木素染色，高倍鏡下觀察5個高倍視野，計穿膜細胞數(shù)。實驗設3個平行樣，并重復一次，取均值。

6．裸鼠種植瘤形成及轉(zhuǎn)移：取20只4～6周齡 Balb/C裸鼠，按完全隨機法分為A-pE-P組和ASPC-1組，各10只。每只裸鼠腹股溝皮下注射1×107個腫瘤細胞。1、5周后處死小鼠，測量腫瘤體積，記錄轉(zhuǎn)移灶。腫瘤體積=1/6×π×長徑×短徑2。

三、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、細胞PTEN mRNA表達

ASPC-1、A-pE和A-pE-P細胞PTEN mRNA相對表達量分別20.33±9.42、14.97±8.17、56.77±16.85(圖1)， A-pE-P細胞的表達較ASPC-1細胞增強179.3%(F=20.35,P<0.01)。

圖1 ASPC-1、A-pE、A-pE-P細胞PTEN mRNA表達

二、細胞PTEN、VEGF和EGFR蛋白表達

ASPC-1、A-pE細胞低表達PTEN，高表達VEGF；A-pE-P細胞高表達PTEN，低表達VEGF；3組細胞EGFR表達無明顯差異(圖2)。

圖2A-pE(上)、A-pE-P(下)細胞的PTEN(a)、VEGF(b)、 EGFR(c)蛋白表達(免疫組化 ×200或400)

三、細胞周期、克隆形成率

A-pE-P細胞G2/M、S期細胞較ASPC-1、A-pE細胞顯著增多；G1期細胞減少(表1)。ASPC-1、A-pE、A-pE-P細胞的克隆形成數(shù)分別為(33.3±3.4)、(31.7±4.3)、(24.0±3.9)個，A-pE-P組較ASPC-3組降低了28.0%(F=4.283,P<0.05)。

表1 各組ASPC-1細胞周期的分布

四、細胞體外侵襲能力

ASPC-1、A-pE、A-pE-P組的穿膜細胞數(shù)為(63.8±7.5)、(61.5±6.3)、(46.3±6.6)個，A-pE-P組較ASPC-3組顯著減少(F=2.476，P<0.05)。

五、種植瘤生長及轉(zhuǎn)移

細胞接種1周后，A-pE-p、ASPC-1組裸鼠均出現(xiàn)瘤結(jié)節(jié)，成瘤率100%，瘤體積為(1.3±0.1)mm3和(1.4±0.2)mm3，無顯著差異，均未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶；5周時，A-pE-p組瘤體積為(142.4±30.9)mm3，顯著小于ASPC1組的(202.7±43.6)mm3(t=4.834，P<0.01)，抑瘤率達42.4%。A-pE-P組發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶(2.0±0.7)個，顯著低于ASPC-1組的(5.0±1.3)個(t=0.451，P<0.01)。轉(zhuǎn)移以肺臟、腋下和腹股溝淋巴結(jié)為主，僅1只出現(xiàn)腹腔轉(zhuǎn)移。

討 論

PTEN參與細胞分裂、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、炎癥反應及ECM代謝等多種生物學過程[1]。PTEN編碼雙重底物特異性磷酸酶，具有蛋白磷酸酶活性和脂質(zhì)磷酸酶活性，其蛋白磷酸酶活性在抑制腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移過程中起主要作用[2-3]，PTEN可通過抑制PIP3激酶活性，阻斷Akt的作用[4]，使細胞阻滯在G2/M期，同時啟動凋亡程序，抑制腫瘤細胞增殖[5]。

本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染PTEN的ASPC-1細胞明顯被阻滯在G2/M期，并有部分細胞產(chǎn)生凋亡，與Saito等[6]的研究結(jié)果一致。但有研究結(jié)果顯示，PTEN使細胞阻滯在G1期。這種分歧可能因PTEN對細胞周期的調(diào)節(jié)有細胞型和劑量依賴性的差別。此外，轉(zhuǎn)染PTEN的ASPC-1細胞VEGF蛋白表達明顯減弱，而EGFR蛋白表達水平無明顯改變，表明PTEN可抑制VEGF的表達，而與EGFR表達無關。

本實驗結(jié)果還顯示，種植A-pE-P細胞的裸鼠，瘤塊生長緩慢，轉(zhuǎn)移灶數(shù)目減少，表明PTEN蛋白的過表達可能通過減少細胞VEGF蛋白的表達達到抑制腫瘤細胞生長及轉(zhuǎn)移的能力。

[1] Chu EC, Tarnawski AS. PTEN regulatory functions in tumor suppression and cell biology. Med Sci Monit, 2004,10: RA235-RA241.

[2] Rinker-Schaeffer CW,O′Keefe JP,Welch DR, et al.Metastasis suppressor proteins: discovery,molecular mechanisms,and clinical application.Clin Cancer Res,2006,12: 3882-3889.

[3] Okumura K, Zhao M, DePinho RA, et al. PTEN: a novel anti-oncogenic function independent of phosphatase activity. Cell Cycle,2005, 4: 540-542.

[4] Kandel ES, Skeen J, Majewski N, et al. Activation of Akt/protein kinase B overcomes a G2/M cell cycle checkpoint induced by DNA damage. Mol Cell Biol, 2002, 22: 7831-7841.

[5] 楊志芳,易繼林,李興睿,等. PTEN依賴其磷酸酶活性誘導肝癌發(fā)生失巢凋亡機制的探討.中華腫瘤雜志, 2005,27:273-275.

[6] Saito Y, Swanson X, Mhashilkar AM, et al. Adenovirus-mediated transfer of the PTEN gene inhibits human colorectal cancer growth in vitro and in vivo. Gene Ther, 2003, 10: 1961-1969.

HeterogeneousPTENinhibitsASPC-1cellproliferation,invasionandmetastasis

LIHong-yu,LIJian-jun,LIUXu,WUChun-yan,ZHAOJia-jun,CHENYan-zhi,GUOXiao-zhong.
DepartmentofGastroenterology,ShenyangGeneralHospitalofPLA,Shenyang110840，China

GUOXiao-zhong,Email:guoxiaozhong1962@163.com

ObjectiveTo investigate the effects of heterogeneous phosphatase and tensinhomologue deleted on chromosome ten (PTEN) on cell cycles, proliferation, invasion, tumorigenicity, metastasis and the expressions of vascular endothelial growth factor (VEGF) and epidermal growth factor receptor (EGFR) proteins in human pancreas cancer cell line (ASPC-1).MethodsASPC-1 cells was transfected with plasmid pE-PTEN containing PTEN, and empty plasmid pE-PTEN transfection was used as control, then ASPC-1-pE-PTEN (A-pE-P) cell and ASPC-1-pE (A-pE) cell was obtained. The expression of PTEN mRNA was determined by RT-PCR. PTEN, VEGF and EGFR proteins were measured by cell immunohistochemical method. Clone formation assay was used to observe the numbers of clone. Transwell was used to test the invasion ability of cells. The growths of tumor were detected by nude mice subcutaneous injection of cancer cells in vivo.ResultsCompared with ASPC-1, the expressions of PTEN mRNA of A-pE-P increased by 179.3%, and the expressions of PTEN protein were also significantly increased. The expressions of VEGF protein were significantly decreased. The expressions of EGFR protein were not significantly changed. Number of G2/M phase cells was significantly increased from (26.81±1.03)% to (31.5±1.76)% (P<0.05). The numbers of clone was decreased by 28%(P<0.05). The number of penetrating cells was decreased [(46.3±6.6)vs(63.8±7.5) per high power field,P<0.05]. The tumor volumes were significantly reduced [(142.4±30.9)vs(202.7±43.6) mm3,P<0.05]. The tumor inhibitory rate was 42.4%. The distant metastases were significantly reduced [(2.0±0.7)vs(5.0±1.3),P<0.01].ConclusionsHeterogeneous PTEN can not only inhibit the proliferation, invasion and metastasis of ASPC-1 cells, arrest the cell growth at G2/M phase, but also decrease the expressions of VEGF.

Pancreatic neoplasms; Gene, tumor suppressor; Transfection; Phosphatase and tensinhomology deleted on chromosome ten

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.01.005

遼寧省博士啟動基金(20081044)；遼寧省教育廳基金(L2010627)

110840 沈陽，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院消化內(nèi)科(李宏宇、郭曉鐘、劉旭、吳春燕、趙佳鈞)；中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院放療科(李建軍、陳延志)

郭曉鐘，Email: guoxiaozhong1962@163.com

2011-04-27)

(本文編輯：呂芳萍)