胡金樹，于慶杰，朱一堂，丁繼生

（滄州市中心醫(yī)院 檢 驗(yàn)科，河北 滄 州061001）

細(xì)菌生物被膜是發(fā)生呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎的重要原因，在對(duì)生物被膜的研究中很多物質(zhì)能抑制生物被膜，但增加了細(xì)菌的耐藥性，本文主要研究殼聚糖對(duì)大腸埃希菌生物被膜的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 實(shí)驗(yàn)菌株：臨床標(biāo)本中分離，經(jīng)API20E鑒定的大腸埃希菌；藥敏質(zhì)控菌株ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCC700603、陰溝腸桿菌029M購自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.1.2 材料和儀器 殼聚糖：分子量30萬，脫乙酰度大于85%，浙江金殼生物化學(xué)有限公司；氣管導(dǎo)管規(guī)格8.0 mm，廣州韋士泰醫(yī)療器械有限公司。

藥敏紙片：OXIOD公司，分別是哌拉西林／他唑巴坦（TZP）、左氧沙星（LEV）、亞胺培南（IPM）、慶大霉素（CN）、阿米卡星（AK）、頭孢曲松（CRO）、頭孢噻肟（CTX）、頭孢他啶（CAZ）、頭孢呋新（CXM）、阿莫西林／棒（AMC）、頭孢西丁（FOX）、頭孢噻肟／克拉維酸 （CTX／CLAX）、頭孢他啶／克 拉 維 酸（CAZ／CLAV）。

儀器：掃描電子顯微鏡：日本電子JSM－5600LV型。

1.2 方法

1.2.1 大腸埃希菌生物被膜模型的培養(yǎng) 稱量殼聚糖適量放入3%乙酸溶液10 ml中浸泡后，加入適量甘油和無水乙醇攪拌均勻，在導(dǎo)管內(nèi)壁涂層，自然干燥后放入10%NaOH溶液中固定20 min，用蒸餾水沖洗至中性。取新鮮菌落放入生理鹽水，調(diào)至吸光度為0.145，以此作為菌懸液。按文獻(xiàn)方法［1］并改良。吸取0.1 ml菌懸液種入含有4.9 ml生理鹽水及1 cm長(zhǎng)導(dǎo)管的無菌杯中（導(dǎo)管水平放置），36℃培養(yǎng)，隔日更換液體，培養(yǎng)7 d得到BF。7天后，將導(dǎo)管的外壁用酒精紗布反復(fù)擦拭，生理鹽水反復(fù)沖洗其內(nèi)壁、外壁和套囊孔，以去除未粘附細(xì)菌及殘余酒精。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 空白組為浮游菌組，對(duì)照組為由空白導(dǎo)管制備的生物被膜組，實(shí)驗(yàn)組為包被分子量30萬殼聚糖的導(dǎo)管制備的生物被膜組，每組標(biāo)本為12例。

1.2.3 掃描電鏡觀察對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組

1.2.4 酶的檢測(cè)和細(xì)菌藥敏 ESBLs的檢測(cè)，CTX、CTX／CLAX 及 CAZ、CAZ／CLAV 中任何1對(duì)紙片抑菌環(huán)直徑差≥5 mm時(shí)，判斷為ESBLs陽性株。肺炎克雷伯ATCC700603作為陽性對(duì)照。Amp C的檢測(cè)，先用FOX檢測(cè)，抑菌環(huán)直徑≤18 mm的菌株，若FEP、TPM 表現(xiàn)為敏感，而CTX、CTX／CLAX 和 CAZ／CLAV 表現(xiàn)為耐藥，或在CTX、CTX／CLAX和CAZ／CLAV的抑菌環(huán)內(nèi)存在散在的菌落，判斷為Amp C陽性。陰溝腸桿菌029M作為AmpC酶陽性對(duì)照，肺炎克雷伯ATCC700603作為Amp C酶陰性對(duì)照。藥敏采用KB法，判斷標(biāo)準(zhǔn)以CLSI為準(zhǔn)則。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)方法 兩組之間各酶的檢出率進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，設(shè)P＜0.05有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的電鏡照片 圖中對(duì)照組細(xì)菌數(shù)量明顯比實(shí)驗(yàn)組多，不但證明該方法能夠形成生物被膜，還證明30萬分子量的殼聚糖能抑制大腸埃希菌的生物被膜。

表1 各組酶的檢出結(jié)果（菌株／檢出率%，n＝12）

圖1 各實(shí)驗(yàn)組的電鏡照片

2.2 藥敏結(jié)果 各組對(duì)亞胺培南的耐藥率最低，其次是對(duì)加酶抑制劑的抗生素耐藥率較低，對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組對(duì)抗生素的耐藥性高于空白組。整個(gè)結(jié)果見表2。

表2 各組的藥敏率（菌株／耐藥率%）

隨著對(duì)生物被膜的研究，發(fā)現(xiàn)了許多物質(zhì)對(duì)其有抑制作用，但有的增加了耐藥性［2］、對(duì)人體毒性［3］等副作用。殼聚糖是不但對(duì)人體細(xì)胞無毒［4］，而且能夠抑制生物被膜的形成［5］。

本實(shí)驗(yàn)首次選用大腸埃希菌來研究殼聚糖對(duì)生物被膜細(xì)菌耐藥性的影響。耐藥性的比較以ESBLs和AmpC來研究。ESBLs由質(zhì)粒介導(dǎo)，可通過接合、轉(zhuǎn)化和傳導(dǎo)等方式在細(xì)菌種屬之間進(jìn)行傳遞。Amp C酶是指由革蘭陰性桿菌產(chǎn)生的不被克拉維酸抑制的“絲氨酸”頭孢菌素酶組成的一個(gè)酶家簇。

結(jié)果表明生物被膜兩組ESBLs和Amp C酶的檢出率均明顯高于浮游組各酶的檢出率。其中原因可能為BF的細(xì)菌無論在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化特性及致病特點(diǎn)等都與浮游生長(zhǎng)的細(xì)菌顯著不同，開啟了耐藥基因，具有很強(qiáng)的耐藥性［6］。由于BF的形成，促進(jìn)了AmpC和ESBLs的產(chǎn)生，而這兩種酶同時(shí)存在又增加了耐藥性，但是亞胺培南的抗菌活性最高，無耐藥菌株。從藥敏結(jié)果來看，對(duì)其他抗生素的耐藥性較高，可知，對(duì)于該菌感染一定要在藥敏實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)下進(jìn)行治療。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的耐藥性沒有差異，殼聚糖沒有影響生物被膜細(xì)菌的耐藥性，可能是殼聚糖殺滅細(xì)菌的機(jī)理是進(jìn)入細(xì)菌干擾其帶負(fù)電荷的遺傳物質(zhì)DNA和RNA，抑制細(xì)菌的繁殖，是一種物理的靜電吸引作用，不同于常規(guī)的化學(xué)藥物［7］。

綜上所述殼聚糖既對(duì)人體無毒無害、可抑制生物被摸的形成，又未增加細(xì)菌的耐藥性，在醫(yī)學(xué)有潛在價(jià)值。

［1］Ishida H，Ishia Y，urosaka Y，et al.In vitro and in vivo activities of levofloxacin against biofilm－producing pseudomonas aeruginosa［J］.Antimicrob Agents Chemother，1998，42（7）：1641.

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［4］Enríquez de Salamanca A，Diebold Y，Calonge M，et al.Chitosan nanoparticles as a potential drug delivery system for the ocular surface：toxicity，uptake mechanism and in vivo tolerance［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2006 ，47（4）：1416.

［5］Cao Z，Sun Y.N－h(huán)alamine－based chitosan：preparation，characterization，and antimicrobial function［J］.J Biomed Mater Res A，2008，85（1）：99.

［6］Donlan RM，Costorton JW.Biofilms：survival mechanisms of clinically relevant microorganisms［J］.Clin Microbiol Rev，2002，15（2）：167.

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