周 密，李 凡，王艷艷

（1.長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，吉林 長(zhǎng) 春130031；2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院；3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 兒 科）

柯薩奇B4病毒（Coxsackievirus B4，CVB4）屬于腸道病毒屬，可引無(wú)菌性腦膜炎、病毒性胰腺炎、出疹性發(fā)熱等多種臨床疾病。近年研究表明其感染與Ⅰ型糖尿?。═ype 1 diabetes mellitus，T1D）的發(fā)生密切相關(guān)［1，2］。CVB4病毒基因組由約7 395個(gè)堿基構(gòu)成，基因組依次分為5′端非編碼區(qū)（Untranslated Region，UTR）、P1、P2、P3 區(qū)和3′端非編碼區(qū)。雖然5′UTR并不編碼蛋白質(zhì)，但它在病毒復(fù)制增殖和形成感染中發(fā)揮重要作用。研究表明，脊髓灰質(zhì)炎病毒神經(jīng)毒性［3］和CVB3心肌毒力的位點(diǎn)［4］均位于5′UTR。CVB4與其他腸道病毒一樣，具有廣泛的疾病譜，說(shuō)明不同CVB4變異株具有不同的毒力表現(xiàn)。國(guó)外研究主要采用標(biāo)準(zhǔn)株和基因工程株，本研究采用在小鼠中表現(xiàn)為胰腺毒力（引起小鼠糖尿病樣綜合征）的CVB4毒株［5］，將其5′UTR基因克隆測(cè)序，并對(duì)其基因序列的同源性、遺傳進(jìn)化趨勢(shì)及變異性進(jìn)行研究，研究結(jié)果將加深對(duì)該病毒毒力相關(guān)基因的認(rèn)識(shí)，同時(shí)為采用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)相關(guān)疾病進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒及試劑 CVB4jlu06株和Hep－2細(xì)胞株，由吉林大學(xué)保存。細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液（IMDM）為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄酶為Invirogen產(chǎn)品。限制性內(nèi)切酶、Tag DNA聚合酶、RNA提取試劑盒及p MD19－T載體均為Ta KaRa公司產(chǎn)品。

1.2 病毒5′UTR基因的克隆測(cè)序 參照GenBank中標(biāo)準(zhǔn)株CVB4JVB序列（X05690）設(shè)計(jì)5′UTR基因引物，上、下游引物序列分別為：5′－TTAAAACAGCCTGTGGGTTGTACC－3′和 5′－TTTATCGTATTGAGTCTCAATATG－3′。Trizol法提取病毒RNA，以病毒基因組RNA為模板進(jìn)行RT－PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2 min，94℃45 sec，52℃45 sec，72℃2 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分離純化，與p MD19－T載體連接，鑒定后送上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司測(cè)序。

1.3 病毒5′UTR基因序列分析 DNA序列及同源性分析利用DNAStar和MEGA4生物分析軟件進(jìn)行，相關(guān)參比序列選自GenBank，包括CVB4 Tuscany（DQ480420）、CVB4 J.V.B.（X05690）、CVB4 E2b（AF311939）和CVB4 E2（S76772）。

2 結(jié)果

2.1 病毒5′UTR基因序列特點(diǎn) CVB 4jlu06株5′UTR基因由743個(gè)堿基組成，5′UTR之后為編碼區(qū)和3′非編碼區(qū)，這種結(jié)構(gòu)與柯薩奇B4病毒的標(biāo)準(zhǔn)株CVB4JVB相一致。分析發(fā)現(xiàn)，與其他CVB病毒一樣，RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)可分為11個(gè)莖－環(huán)（stemloop）結(jié)構(gòu)（即莖－環(huán)A－K），其中含有富含嘧啶的S－D樣（Shine－Dalgarnolike）序列區(qū)域（序列為 UUCCUUUU），該區(qū)域在病毒復(fù)制過(guò)程中通過(guò)堿基配對(duì)方式完成核糖體進(jìn)入過(guò)程。

2.2 病毒5′UTR核苷酸序列同源性分析 將CVB 4jlu06株5′UTR核苷酸序列與CVB4已發(fā)表序列進(jìn)行同源性分析，其中CVB4jlu06株與CVB4JVB和CVB4Tuscany株顯示了高度的同源性，分別為99.6%和99.5%，而與CVB4E2、CVB4E2b顯示了較大差異性，分別為13.3%和13.5%（如圖1所示）。

圖1 CVB45′UTR核苷酸序列同源性分析

2.3 病毒5′UTR基因遺傳進(jìn)化分析 在同源性分析的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了CVB4的5′UTR核苷酸序列遺傳進(jìn)化樹(shù)（如圖2所示）。CVB4jlu06、CVB4JVB和CVB4Tuscany共同聚簇，顯示了高度同源性，說(shuō)明三者具有相同的進(jìn)化途徑；而CVB4E2、CVB4E2b處于另一個(gè)分支內(nèi)，共同聚簇，與前三者有不同的進(jìn)化途徑。

圖2 CVB45′UTR核苷酸序列遺傳進(jìn)化分析

2.4 病毒5′UTR核苷酸變異分析 采用Megalign分析工具對(duì)病毒5′UTR核苷酸序列進(jìn)行多重比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)在三個(gè)位點(diǎn)jlu06株與E2株、E2b及Tuscany株（致糖尿病株）有共同的核苷酸，而與JVB株（非致糖尿病株）不同。核苷酸及其變異位點(diǎn)分別為C546G（先給出的是jlu06株的核苷酸）、G137A和A136T，這些位點(diǎn)分別位于RNA莖－環(huán)G（SLG）和RNA莖－環(huán)C（SLC）。

3 討論

近年來(lái)，對(duì)腸道病毒基因變異研究表明，病毒RNA一些位點(diǎn)突變可能引起小核糖核酸病毒的重要生物學(xué)特性改變［6］。在對(duì)脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗PV3神經(jīng)毒性研究中發(fā)現(xiàn)，病毒5′UTR的一個(gè)核苷酸的改變就可以使病毒毒力喪失或回復(fù)［3］。在對(duì)CVB3心肌毒力的研究中發(fā)現(xiàn)5′UTR是決定心肌毒力表型的主要區(qū)域（nt88－181）［4］，這些結(jié)果說(shuō)明小RNA病毒5′UTR核苷酸的變異對(duì)決定病毒的毒力表型起著重要作用。5′UTR雖然不編碼蛋白質(zhì)，但由于小RNA病毒在復(fù)制增殖過(guò)程中以非帽依賴方式進(jìn)行，其5′UTR中存在著核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosome entry site，IRES，包括莖－環(huán)結(jié)構(gòu)SLF到SLI），該構(gòu)型中富含嘧啶的S－D樣區(qū)域，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)方式，完成與核糖體的結(jié)合，從而開(kāi)始病毒的復(fù)制。因此，5′UTR結(jié)構(gòu)與病毒的復(fù)制增殖、宿主范圍和毒力等生物學(xué)特征密切相關(guān)［7］。本研究采用來(lái)自中國(guó)本土、在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中引起小鼠糖尿病樣綜合征的CVB4jlu06株，為研究其毒力表現(xiàn)的分子基礎(chǔ)，對(duì)該株病毒5′UTR基因序列進(jìn)行了變異性和遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果表明該株病毒與標(biāo)準(zhǔn)株JVB和Tuscany株具有相同的進(jìn)化途徑，同源性較高，且在該區(qū)域內(nèi)三個(gè)位點(diǎn)的核苷酸發(fā)生了有意義的變異，分別是C546G、G137A和A136T，這些位點(diǎn)與致糖尿株（E2、E2b及Tuscany）相同，而與非致糖尿病株（JVB）不同。C546G位點(diǎn)位于RNA莖－環(huán)G，在核糖體進(jìn)入位點(diǎn)構(gòu)型中，其他兩個(gè)位點(diǎn)位于莖－環(huán)C，上述三個(gè)位點(diǎn)核苷酸的變異可能會(huì)影響到病毒復(fù)制增殖能力，使其具有與標(biāo)準(zhǔn)株不同的致病表型。但上述變異是否決定了該株病毒引起小鼠糖尿病樣綜合征，尚需進(jìn)一步研究確定。未來(lái)可以選擇較多有相同毒力表型的毒株，進(jìn)行基因變異分析，并運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，進(jìn)行基因定位研究，最終確定具有潛在致糖尿病性柯薩奇病毒的毒力相關(guān)基因，為臨床相關(guān)疾病的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)及防治研究奠定基礎(chǔ)。

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