周紅霞，華 春，張紅琳，李俊芳，祝長青，黃 明，周光宏，*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，江蘇南京210095; 2.南京曉莊學(xué)院生物化工與環(huán)境工程學(xué)院，江蘇南京211171; 3.江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇南京 210001）

PCR法定性檢測大豆食用油中轉(zhuǎn)基因成分

周紅霞1，2，華 春2，張紅琳2，李俊芳2，祝長青3，黃 明1，周光宏1，*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，江蘇南京210095; 2.南京曉莊學(xué)院生物化工與環(huán)境工程學(xué)院，江蘇南京211171; 3.江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇南京 210001）

針對大豆食用油中核酸含量低且被嚴(yán)重破壞、DNA難以提取的問題，對CTAB法進(jìn)行優(yōu)化，有效從食用油中提取到可用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)的DNA模板。同時定性檢測出大豆內(nèi)源基因lectin，外源調(diào)控序列啟動子CaMV35S、終止子Nos及目的基因CP4－EPSPS序列，成功建立了基于PCR技術(shù)在大豆食用油中快速檢測轉(zhuǎn)基因成分的方法。

大豆食用油，轉(zhuǎn)基因檢測，DNA提取，PCR

由于轉(zhuǎn)基因生物（GMO）具有抗逆性，產(chǎn)量高，生產(chǎn)成本相對較低，具有較好的市場競爭性和應(yīng)用前景，故隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的飛速發(fā)展，加速了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的市場化、商品化，使其具有較好的市場競爭性及應(yīng)用前景［1］。但轉(zhuǎn)基因生物的廣泛應(yīng)用是否會對生態(tài)環(huán)境和人類生物的健康造成不良影響，至今仍無定論［1］。據(jù)此，歐盟、日本等國家先后制定了轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)識管理政策，以保護(hù)消費(fèi)者的知情權(quán)和選擇權(quán)。我國也要求從2002年3月20日起標(biāo)識市售轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、油菜、番茄、棉花及其加工產(chǎn)品［2］。PCR的技術(shù)手段由于其高效性而成為轉(zhuǎn)基因食品的最常用檢測方法［3－7］。國際通用方法是以PCR技術(shù)為平臺，通過特異擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因調(diào)控原件花椰菜花葉病毒（CaMV35S）啟動子、胭脂堿合酶（NOS）終止子以及目的基因抗除草劑基因CP4－EPSPS來篩選檢測轉(zhuǎn)基因食品［3－7］。食用油作為一種精深加工食品，經(jīng)過240℃高溫和高壓等加工步驟之后，核酸嚴(yán)重破壞，且含量低，提取困難，成為限制檢測其中轉(zhuǎn)基因成分的瓶頸［8－19］。另外食用油的主要成分是脂類物質(zhì)，水溶性的DNA含量相當(dāng)少，因此精煉油中DNA的提取重點是如何有效富集其中的微量DNA。國內(nèi)外有食用大豆油轉(zhuǎn)基因檢測的報道，但多采用試劑盒的方法［8－18］，欒鳳俠［12］比較了CTAB法和W izard試劑盒法提取精煉大豆油DNA的效果，結(jié)果表明試劑盒法提取效果優(yōu)于CTAB法。程紅梅［15］采用了離心柱法從10m L大豆油中提取到0.4μg的DNA，白立群［17］采用冷凍干燥法從20m L食用油中提取到可用于檢測的DNA。Paul［20］和Zhang［21］，分別采用W izard試劑盒法及W izard Magnetic DNA Purification System for Food Kit（Promega）試劑盒提取大豆油中DNA，均認(rèn)為大豆精煉油中不能提取出DNA，因此如何高效提取精煉油中的DNA始終是轉(zhuǎn)基因檢測的瓶頸難點。盡管油脂中轉(zhuǎn)基因成分的檢測已有相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)出臺，但作者通過多次實驗發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)中介紹的方法并不能完全有效地提取油脂中DNA。我們參照前人介紹的方法［11－18］，對其中的某些步驟進(jìn)行了改進(jìn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，改進(jìn)的方法較之于標(biāo)準(zhǔn)方法，其DNA提取的有效性大大提高，所提取的DNA完全能夠用于后續(xù)的PCR檢測，并通過PCR擴(kuò)增CaMV35S啟動子、NOS終止子以及抗除草劑基因CP4－EPSPS來定性檢測轉(zhuǎn)基因食用油，為大豆深加工食品的轉(zhuǎn)基因檢測提供切實可行的基礎(chǔ)。

表1 檢測不同基因所用引物及產(chǎn)物大小Table 1 List of different specific primer and the size of their product

表2 PCR反應(yīng)條件Table 2 PCR reaction conditions

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

福臨門一級大豆食用油、豆維家大豆食用油、金龍魚大豆食用油 均從超市購得;轉(zhuǎn)基因大豆、非轉(zhuǎn)基因大豆 江蘇出入境檢驗檢疫局惠贈;CTAB、Tris、SDS、Taq酶、核酸共沉淀劑（DNAmate）、引物上海生工。

凝膠成像儀GelDoc 2000 system 美國BioRad公 司;Mastercyclerep personal PCR 儀 德 國Enpendorf公司;水平電泳儀 北京百晶生物技術(shù)有限公司;Ultraturrax T25高速勻漿器 德國 IKAWERKE公司。

1.2 引物

大豆食用油中Lectin內(nèi)源基因、CaMV35S啟動子基因、NOS終止子基因、CP4－EPSPS外源基因的引物序列見表1［19］。

1.3 實驗方法

1.3.1 大豆食用油中DNA的提取 參照前人方法［11－18］，取1m L食用油到2m L離心管中，加入400μL的TE緩沖液，顛倒搖勻5m in，常溫13000 r/min離心3min，去除上層油脂層，在同一只離心管中再加入1m L的食用油，顛倒搖勻5m in，常溫13000 r/m in離心3m in，去除上層油脂層，以上步驟重復(fù)15～20次。取水相轉(zhuǎn)移至新的 2m L離心管中，在水相中加400μL的CTAB提取液和2μL的RNA酶，渦旋震蕩1～3s，65℃水浴30m in后加入等體積的三氯甲烷/異戊醇（24∶1），輕緩顛倒數(shù)次后靜置 5m in，常溫13000 r/min離心3m in，轉(zhuǎn)移上清液置于另一個2m L的離心管中。加入上清液 1/10體積的3mmol/L NaAc（pH 5.2）溶液，均勻混合，再加入4μL的DNA共沉淀劑溶液，均勻混合。轉(zhuǎn)移離心管中一半的溶液于另一個新的2m L離心管中，分別加入2.5倍體積的－20℃預(yù)冷的無水乙醇，充分混勻，12000 r/m in 4℃條件下離心20min，棄溶液，留白色沉淀。加入－20℃預(yù)冷的70%乙醇1m L，洗滌沉淀兩次。12000 r/m in 4℃條件下離心5m in后小心棄去乙醇，自然干燥。每個離心管中加30μL 0.1×TE緩沖液溶解沉淀，4℃保存?zhèn)溆谩Ｒ匀ルx子水作空白對照。

1.3.2 PCR檢測大豆食用油DNA的轉(zhuǎn)基因成分

1.3.2.1 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 反應(yīng)體系:10× PCR Buffer 2.5μL，25mmol/L MgCl22.5μL，dNTP 2.5mmol/L 2.0μL，20pmol/μL引物（正:0.25μL，反: 0.25μL），5U/μL Taq酶0.125μL，DNA模板通常取量為2～5.0μL，所補(bǔ)超純水量隨DNA模板量而變化，最終補(bǔ)足25μL。PCR反應(yīng)條件見表2，同時設(shè)陽性對照、陰性對照、空白對照。

1.3.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物 取5μL PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，緩沖液為用1×TAE電泳緩沖液，在5V/cm電壓中電泳20m in，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA的提取

將提取的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果沒有條帶出現(xiàn)（結(jié)果未顯示），分析原因是由于食用油脂中DNA含量非常低，以致常規(guī)的凝膠電泳無法顯示。因為提取過程加入核酸共沉淀劑，因此提取后的目標(biāo)DNA含量及純度無法用紫外分光光度法確定，紫外所獲取的OD值，都可能是核酸共沉淀劑和目標(biāo)DNA的混合信息。

2.2 大豆內(nèi)源基因Lectin的檢測

Lectin基因是大豆所特有的內(nèi)源性基因，任何以大豆為原料制備的產(chǎn)品均應(yīng)含有該基因。檢測內(nèi)源基因可以判斷從食用油中是否成功提取到DNA，以及所提取的DNA是否適合于PCR擴(kuò)增，同時還可以判斷所提取的DNA是否含有PCR擴(kuò)增抑制物，從而避免結(jié)果出現(xiàn)假陰性。按表2的PCR條件首先檢測了Lectin基因，以水代替DNA模板為空白對照，以非轉(zhuǎn)基因大豆為陰性對照，以轉(zhuǎn)基因大豆為陽性對照，以提取過程中添加的DNA共沉淀劑代替DNA模板作為對照，排除其引物模板的可能性。圖1顯示了大豆內(nèi)源基因Lectin的檢測結(jié)果，三種油、轉(zhuǎn)基因大豆、非轉(zhuǎn)基因大豆均能擴(kuò)增出約118bp左右的片段，說明所提取的DNA質(zhì)量較好，可用作PCR檢測模板。DNA共沉淀劑在PCR檢測中無新條帶出現(xiàn)，說明其增加了提取效率但并沒有引入外源基因，可以作為安全的DNA共沉淀劑。第六泳道陽性對照擴(kuò)增的條帶亮度低于三種大豆食用油的主要原因為陽性對照DNA和食用油中DNA提取時間不一致，陽性對照大量提取一次，存放備用，可能存放的時間比較久。

圖1 PCR檢測大豆油內(nèi)源基因LectinFig.1 PCR amplification results of endogenous Lectin in DNA sample of soybean oil

2.3 大豆食用油中外源基因的檢測

外源基因的檢測通常包括兩方面:一是調(diào)控基因的檢測，另一個是目的基因的檢測。首先我們對調(diào)控基因CaMV35S啟動子和NOS終止子按表2的PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增檢測，結(jié)果見圖2和圖3。由此可以看出轉(zhuǎn)基因大豆和三個品種的大豆食用油均能擴(kuò)增出約195bp的CaMV35S啟動子（圖2）和約180bp的NOS終止子片段（圖3）。

圖2 大豆食用油CaMV35S啟動子的PCR檢測Fig.2 PCR amplification results of CaMV35S promoter in DNA sample of soybean oil

圖3 大豆食用油NOS終止子的PCR檢測Fig.3 PCR amplification results of NOS terminator in DNA sample of soybean oil

由于CaMV35S啟動子來源于花椰菜花葉病毒，NOS終止子來源于根癌農(nóng)桿菌，因此若原料大豆被花椰菜花葉病毒或被根癌農(nóng)桿菌侵染，就會有假陽性出現(xiàn)。因此除了檢測調(diào)控基因還要檢測目的基因CP4－EPSPS才能下最終結(jié)論。

利用改進(jìn)方法提取的三個品種大豆食用油中的DNA，用CP4－EPSPS引物按表2的PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增，以水代替DNA模板為空白對照，以非轉(zhuǎn)基因大豆為陰性對照，以轉(zhuǎn)基因大豆為陽性對照，結(jié)果見圖4。由圖4可以看出，所提取的DNA可以成功檢測到目的基因CP4－EPSPS320bp片段，且擴(kuò)增出的片段與轉(zhuǎn)基因大豆一致，而非轉(zhuǎn)基因大豆和水空白對照均未檢測出該片段。據(jù)國內(nèi)檢測機(jī)構(gòu)反映，通常在精煉食用油中能檢測到35S啟動子和NOS終止子，但是檢測不到CP4－EPSPS目的基因，因此，本研究所建立的大豆食用油DNA提取方法簡單方便，可用于大豆深加工DNA提取的檢測。

3 討論

精煉油中DNA提取的重點是如何有效地富集大豆油中微量DNA，本文在前人基礎(chǔ)上分別對DNA提取和PCR檢測作了如下改進(jìn)，取得了滿意的檢測效果。

a.提取樣品的初始量是能否成功提取DNA的關(guān)鍵因素。文獻(xiàn)［9－11］中報道的1～5m L的樣品量難以提取到可供PCR檢測的DNA量，當(dāng)樣品量增加到20m L時，可成功檢測到（見圖1～圖3）。

圖4 大豆油目的基因CP4－EPSPS的PCR檢測Fig.4 PCR amplification results of CP4－EPSPS in DNA smample of soybean oil

b.提取開始前利用DNA可溶于水溶液的特性，在食用油脂中加入一定體積的TE溶液進(jìn)行洗滌以萃取其中含量極少的DNA;另外顛倒搖勻時切忌劇烈震蕩，否則會破壞DNA。

c.為了提高食用油中DNA的沉淀效果可加入核酸共沉淀劑，共沉淀劑最好選擇與目標(biāo)DNA相差較遠(yuǎn)的物種，以本研究所用的核酸共沉淀劑作為PCR反應(yīng)的陰性對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不干擾待測目標(biāo)片段的檢出（見圖1第6泳道）。

d.沉淀DNA的步驟中加入NaAc，NaAc提供弱酸環(huán)境，可促使DNA沉淀。

e.本文研究中發(fā)現(xiàn)，為了提高CP4－EPSPS基因檢出成功率，目的片段的穩(wěn)定性比長短更重要。本文曾經(jīng)選擇170bp大小的目的片段，但沒有檢測到（結(jié)果未顯示），最后選擇富含GC堿基對的823－1143序列作為檢測目的片段，PCR最終獲得成功（見圖4），分析可能的原因是，這段序列富含GC，在加工中穩(wěn)定性好，不容易被破壞，所以雖然目的片段變長，但依然可以成功檢測到。這一發(fā)現(xiàn)可應(yīng)用于其他深加工轉(zhuǎn)基因食品的檢測中。

本研究成功建立了基于PCR技術(shù)在大豆食用油中快速檢測轉(zhuǎn)基因成分的方法。該方法所檢測的CaMV35S啟動子、NOS終止子、CP4－EPSPS等基本覆蓋了世界上已商品化的轉(zhuǎn)基因大豆及其深加工產(chǎn)品，因此所建立的檢測體系具有通用性，該方法利用大豆內(nèi)源基因Lectin作為內(nèi)參照，可以直接檢測提取的DNA質(zhì)量，同時設(shè)立了陽性質(zhì)控、陰性質(zhì)控和空白對照，從而避免了假陰性、假陽性以及污染可能造成的假性結(jié)果，保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性，基本滿足各國及地區(qū)定性檢測，在篩選過程中若為陰性的樣品，可直接判斷為陰性，若為陽性，可進(jìn)一步做鑒定檢測。

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Detection of genetically modified com ponents in soybean oil by PCR

ZHOU Hong－xia1，2，HUA Chun2，ZHANG Hong－lin2，LI Jun－fang2，ZHU Chang－qing3，HUANG M ing1，ZHOU Guang－h(huán)ong1，*
（1.National Center of Meat Quality and Safety Control，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China; 2.School of Biochemical and Environmental Engineering，Nanjing Xiaozhuang University，Nanjing 211171，China; 3.Nanjing Entry－exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanjing 210001，China）

A qualitative m ethod for detecting of transgenic genes in ed ib le oils was reported.It was norm ally considered that ed ib le oils，especially refining oils，w ith low content DNA，RNA and p roteins.A usefulmethod for extrac tion DNA from the ed ib le oilsam p les was estab lished，it could be used as tem p late for PCR.The endogenous genes（Lec tin）and transgenic genes（CaMV35S，Nos，CP4－EPSPS）were detec ted in the ed ib le oil sam p les by the PCRmehtod.

soybean oils;detection GMO;DNA extrac tion;PCR

TS207.3

A

1002－0306（2012）06－0087－05

2011－04－26 *通訊聯(lián)系人

周紅霞（1976－），女，副教授，博士后，研究方向:食品生物技術(shù)。

農(nóng)業(yè)部《轉(zhuǎn)基因重大專項》（2009ZX08012－014B）;江蘇省教育廳高校自然科學(xué)與研究項目（10KJD550005）。