許慶金，鄧志瑞，張文舉，陳 沁

(上海大學生命科學學院，上海200444)

牛奶過敏原PCR檢測方法的建立

許慶金，鄧志瑞，張文舉，陳 沁*

(上海大學生命科學學院，上海200444)

牛奶是主要的食品過敏原之一，其中β－乳球蛋白是引起牛奶過敏的主要成分?；谂Ｄ苔拢榍虻鞍谆蛐蛄性O(shè)計一對PCR引物，經(jīng)過反應條件的優(yōu)化，建立了適合檢測牛奶β－乳球蛋白過敏原的PCR方法。實驗結(jié)果表明，當PCR反應體系中模板DNA量為25ng，引物濃度為4mmol/L時，檢測效果最佳。所建立的方法不僅可用于不同保質(zhì)期、不同來源牛奶β－乳球蛋白過敏原的測定，亦可用于牛、羊奶不同比例混合物中β－乳球蛋白過敏原的檢測。

β－乳球蛋白，PCR，牛奶過敏原

食物過敏(food allergy)是食物刺激有機體產(chǎn)生的變態(tài)反應［1］，微小的劑量即可在幾分鐘之內(nèi)引起皮膚以及腸道等的疾病，嚴重者甚至導致休克死亡。發(fā)達國家每年有超過20%的人受過敏性疾病的困擾。聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO，995)報告的八類主要的過敏原食物是牛奶、雞蛋、魚、甲殼類(蝦、蟹)、大豆、花生、核果類(杏、板栗、腰果)以及小麥。牛奶是其中最常見的過敏原之一，在小于3歲的嬰幼兒中發(fā)病率為1.6%～2.8%［2］。而β－乳球蛋白是牛奶致敏的主要成分［3］。牛奶過敏已引起社會的關(guān)注，日本、澳洲和西方國家要求含有牛奶成分的食品必須標明牛奶過敏標示［4－5］。目前，牛奶過敏原的檢測方法主要有基于蛋白質(zhì)檢測的SDS－PAGE、HPLC和HPLC－MS等［6－7］。這些方法本可直接檢測到過敏原蛋白，但在食品加工過程中，蛋白質(zhì)空間構(gòu)象易被破壞，從而影響檢測準確性，目前已有研究證實變性后的部分蛋白可與抗體結(jié)合引起假陽性［8－9］;此外，上述方法存在檢測周期較長、不穩(wěn)定因素多、工作量大等缺點［10］。PCR技術(shù)在食品檢測中的成功應用在一定程度上可解決上述問題。鑒于此，本文針對牛奶中引起過敏的β－乳球蛋白對應的基因序列設(shè)計引物，擬建立檢測牛奶過敏原的PCR方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

牛奶和羊奶 好又多超市;dNTPs、Taq酶和10 ×PCP buffer(Mg2+plus) 天根生物科技(北京)有限責任公司;引物 由上海生工生物工程有限公司合成;TEN溶液 1mL Tris－HCl溶液(1mol/L，pH 7.4)+0.2mL EDTA溶液(0.5mol/L)+0.5844g NaCl固體，定容至100mL;其他試劑 按常規(guī)方法配制。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA的提取 牛奶DNA的提取參照徐仙等［11］、田雨［12］及Sharma D等［13］的方法，稍作修改。

a.取35mL牛奶(羊奶)置于50mL潔凈的離心管中，4℃，3000r/min離心10min，棄上清液，在超凈臺中用脫脂棉球小心拭去管壁上的脂類物質(zhì);b.加10mL PBS溶液，溶解沉淀，4℃，3000r/min離心10min，棄上清液，再次在超凈臺中用脫脂棉球小心去脂;c.4℃，10000r/min離心1min，去上清液;d.加440μL TEN溶液和60μL NaOH溶液，轉(zhuǎn)入無菌的 Eppendorf管(1.5mL)中，置于95℃條件下8min，冷卻5min，4℃，10000r/min離心 5s，轉(zhuǎn)移上清至新的無菌的Eppendorf管(1.5mL)中;e.加等體積SEVGA(氯仿∶異戊醇 =24∶1)，混合混勻，4℃，12000r/min離心10min，取上清液;f.加等體積(－20℃)預冷的異丙醇，－20℃放置40min，13000r/min離心15min，棄上清液;g.加300μL 70%乙醇，12000r/min離心5min，去上清液;h.加50μL雙蒸水，測DNA濃度和純度，分裝，低溫(－20℃)保存。

1.2.2 PCR引物設(shè)計 針對牛β－乳球蛋白基因設(shè)計引物 FCM/RCM，序列見表 1，目的條帶大小為1.8kb。

1.2.3 PCR反應體系和條件 PCR擴增反應總體系20μL，包含2μL PCR buffer(Mg2+plus)，3.2μL dNTP (2.5mmol/L)，2μL DNA模板，1μL引物(each 3μmol/L)，0.4μL Taq酶(2.5U/mL)，10.4μL雙蒸水;同時設(shè)置空白對照，即在20μL PCR體系中使用等量雙蒸水代替DNA。

PCR反應條件為:94℃預變性4min，94℃變性30s，68℃退火1min，72℃延伸2min，35個循環(huán)，72℃再延伸10min，4℃保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

表1 PCR引物序列Table 1 Sequence of PCR primer

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA濃度對PCR結(jié)果的影響

分別選取不同量的DNA(5、10、15、20、25、50ng)為模板，以FCM/RCM為引物進行PCR擴增，電泳結(jié)果見圖1。由圖1可知，當DNA含量低于15ng時無目的條帶出現(xiàn)，15ng時開始出現(xiàn)目的條帶但較弱，加大DNA用量時，目的條帶愈加清晰。當DNA用量為50ng時，模板中的雜質(zhì)含量也同時上升，此時PCR擴增也易受雜質(zhì)干擾出現(xiàn)雜帶，因而選用25ng為后續(xù)實驗的DNA用量。

圖1 DNA濃度對PCR擴增的影響Fig.1 Effect of DNA concentrations on PCR amplification

2.2 引物濃度對PCR擴增的影響

DNA用量為25ng時，設(shè)定引物FCM/RCM的不同濃度(1、2、3、4、5、10、20mmol/L)進行PCR擴增，電泳結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，引物濃度為1mmol/L時，無目的條帶擴增;增大至2mmol/L和3mmol/L時，目的條帶清晰度較低;當引物濃度為4mmol/L時，目的條帶較清晰;大于4mmol/L時，開始有微弱的非特異性雜帶出現(xiàn)，且隨著引物濃度的增大，非特異性趨于明顯，綜上所述，選擇4mmol/L作為最終的引物濃度。

圖2 引物濃度對PCR擴增的影響Fig.2 Effect of primer concentrations on PCR amplification

2.3 保質(zhì)期對PCR擴增的影響

取不同保質(zhì)期的品牌A牛奶(7、21、45、180d)提取DNA，進行PCR擴增，電泳結(jié)果見圖3。由圖3可知，保質(zhì)期7d的A品牌鮮牛奶目的條帶最強，保質(zhì)期21d的目的條帶強度次之，保質(zhì)期45d的純牛奶條帶最弱，保質(zhì)期180d的A品牌純牛奶沒有PCR擴增。

圖3 保質(zhì)期對PCR擴增的影響Fig.3 Effect of shelf lives on PCR amplification

2.4 不同品牌牛奶的PCR擴增結(jié)果

在優(yōu)化PCR體系后，分別取四種不同品牌的鮮牛奶(A、B、C、D)提取DNA，進行PCR擴增電泳，結(jié)果如圖4所示。由圖4可見，四種品牌的牛奶均出現(xiàn)了目的條帶，且條帶的差異不大，說明不同品牌的鮮牛奶中均含有此種過敏原。

2.5 牛奶過敏原PCR檢測方法的特異性

為考察所建立的PCR檢測方法的特異性，以A品牌純牛奶DNA模板為陽性對照，分別取不同品牌的羊奶(頂羊，御寶，陽春)提取DNA，進行PCR擴增，實驗結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，A品牌純牛奶(21d)出現(xiàn)了清晰的目的條帶，而不同來源的羊奶未出現(xiàn)相應目的條帶，表明引物FCM/RCM具有較好的特異性。

2.6 A品牌純牛奶和頂羊純羊奶混合物的PCR檢測

將A品牌純牛奶(21d)和頂羊羊奶(30d)按不同比例(牛奶∶羊奶=0.5∶1，1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，10∶1)混合，上述混合物提取DNA，PCR擴增結(jié)果如圖6所示。由圖6可見，目的條帶隨著牛奶比例的提升從無到有，從弱到強;在牛奶∶羊奶=3∶1(V/V)時開始出現(xiàn)微弱的目的條帶;4∶1、5∶1和10∶1時，目的條帶較為清晰。

圖4 不同品牌牛奶PCR擴增結(jié)果Fig.4 PCR results of different brands milk

圖5 A品牌純牛奶和不同品牌羊奶PCR結(jié)果Fig.5 PCR results of brand A pure milk and different brands goat milk

圖6 A品牌純牛奶和頂羊純羊奶混合物PCR結(jié)果Fig.6 PCR results of mixture of brand A pure milk and Dingyang pure goat milk

為進一步確認PCR檢測方法的臨界點，在牛奶∶羊奶=3∶1(V/V，下同)附近設(shè)置了更多的混合比例(牛奶∶羊奶=1.5∶1，2∶1，2.2∶1，2.4∶1，2.6∶1，2.8∶1，3∶1)，PCR擴增結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，在牛奶∶羊奶=2.6∶1(V/V)時，目的條帶開始出現(xiàn)但較弱;小于2.6∶1的比例混合時，沒有目的條帶出現(xiàn)，可以初步認定在本實驗條件下，牛奶∶羊奶=2.6∶1 (V/V)為檢測的臨界值。

圖7 不同比例混合的牛奶和羊奶PCR結(jié)果Fig.7 PCR results of mixture with different ratios of milk and goat milk

3 討論

DNA和引物的用量是影響PCR擴增的重要因素，只有在適宜的濃度范圍內(nèi)才能得到理想的擴增條帶［14－15］。過低的DNA模板量和引物用量使得擴增效率低下甚至擴增不出對應的目的條帶;DNA過量時引物會過早耗盡，使得擴增產(chǎn)物與模板DNA之間發(fā)生退火或者擴增產(chǎn)物之間發(fā)生退火，導致出現(xiàn)彌散狀背景［15］;過高的引物用量傾向于形成非特異性產(chǎn)物，同時形成大量引物二聚體。所以本實驗考察了模板量和引物用量對PCR擴增的影響，結(jié)果證實隨著DNA量的增加，目的條帶呈現(xiàn)增強的趨勢;在15ng以下幾乎檢測不到牛奶過敏原的存在;DNA用量為25ng時可以得到較為清晰、分辨率較高的條帶;在設(shè)定的7個引物濃度梯度中，最佳引物用量為4mmol/L。

實際商品檢測中，不同處理(加熱、酸堿等)方式及保存方式對DNA提取和PCR檢驗結(jié)果也會有一定影響［14，16－17］。Gawienowski M C等［16］研究表明，經(jīng)浸泡、濕磨等加工過程能使玉米基因和質(zhì)粒DNA降解，135℃加熱2h后，DNA幾乎完全降解;Kharazmi M等［17］認為，浸泡后又經(jīng)過物理破碎處理而做成的豆奶、豆腐和熱加工做成的玉米糊和馬鈴薯，沒有檢測出大于1.1kb的DNA片段。本實驗提取不同保質(zhì)期的牛奶DNA，同等模板量進行PCR擴增，結(jié)果表明不同保質(zhì)期的牛奶PCR結(jié)果有一定差異。

PCR方法的特異性主要體現(xiàn)在特異引物與靶基因的專一、有效的結(jié)合上，而與其他相似的序列無法進行結(jié)合［18］。在牛奶和不同品牌羊奶的對照實驗中，結(jié)果顯示引物FCM/RCM不會與羊奶基因組DNA發(fā)生特異性結(jié)合，無目的條帶產(chǎn)生，這說明本方法特異性較好。因此，本方法可用于牛奶過敏原的特異性檢測。

與牛奶相比，羊奶中的β－乳球蛋白的含量比牛奶低，且氨基酸排列順序與牛奶不同，較牛奶更易消化，因此羊奶可以解除大部分牛奶過敏癥［19］;但是羊奶產(chǎn)量較低，因此有不法商家將牛奶摻雜進羊奶銷售，此種混合物難以用肉眼進行區(qū)分，所以本文按不同比例將牛奶混合進羊奶之中，使用本文建立的PCR方法檢測羊奶之中的牛奶含量。結(jié)果表明，當牛奶∶羊奶比例為2.6∶1(V/V)時，能檢測出來羊奶之中的牛奶成分，更多這方面的應用正在進一步的實驗中。

［1］Johansson S G，Bieber T，Dahl R，et al.Revised nomenclature for allergy for global use:report of the Nomenclature Review Commol/Littee of the World Allergy Organization，October 2003［C］.J Allergy Clin Immol/Lunol，2004，113:832－836.

［2］Besler M，Eigenmann P，Schwartz R H.Allergen data collection－Update:Cow’s Milk［C］.Internet Symposium on Food Allergens，2002(4):19－106.

［3］Natale M C，Bisson G，Monti A，et al.Cow’s milk allergens identification by two－dimensional immol/Lunoblotting and mass spectrometry［J］.Mol Nutr Food Res，2004，48:363－369.

［4］Swiss Food Law:Art.8 Abs.1 der Verordnung u¨ber die Kennzeichnung und Anpreisung von Lebensmitteln［S］.2005，23 (11).

［5］Directive 2003/89 EC of the European Parliament and Council and its Annex IIIa［S］.

［6］Wal J M，Bernard H，Yvon M，et al.Enzyme immol/Lunoassay of specific human IgE to purified cow’s milk allergens［J］.Food Agric Immol/Lunol，1995(7):175－187.

［7］Wal J M.Cow’s milk proteins/allergens.Ann Allergy Asthma Immol/Lunol［J］.2002，89:3－10.

［8］Kleber N，Maier S，Hinrichs J.Antigenic response of bovine β－lactoglobulin influenced by ultra－h(huán)igh pressure treatment and temperature［J］.Innovative Food Science and Emerging Technologies，2007(8):39－45.

［9］Bugyi Z，Nagy J，k T?r? K，et al.Towards development of incurred materials for quality assurance purposes in the analysis of food allergens［J］.Analytica Chimica Acta，2010，672:25－29.

［10］Van Hengel A G.Food allergen detection method sand the challenge to protect food－allergic consumers［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2007，389:111－118.

［11］徐仙，陳沁，雍克嵐，等.PCR方法在區(qū)分牛奶牧場來源中的應用［J］.食品科技，2008，33(12):258－261.

［12］田雨.從牛奶中分離DNA方法的建立［J］.乳業(yè)科學與技術(shù)，2006，118(3):112－113.

［13］PirondiniA，BonasU，MaestriE，etal.Yieldand amplificability ofdifferentDNA extraction procedures for traceability in the dairy food chain［J］.Food Control，2010，21: 663－668.

［14］王渭霞，賴鳳香，洪利英，等.轉(zhuǎn)基因水稻DNA樣品濃度以及存放條件對PCR定性檢測的影響［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，2010，18(5):846－852.

［15］李苗，高麗美，李永鋒，等.增強UV－B輻射對小麥幼苗基因組DNA的影響及RAPD分析體系的建立［J］.生物技術(shù)通報，2010(5):87－92.

［16］Gawienowski M C，Eckhoff S R，Ping Y，et al.Fate of maize DNA during steeping wet milling and processing［J］.Cereal Chem，1999，76(3):371－374.

［17］Kharazmi M，Bauer T，Hammol/Les W P，et al.Effect of food processing on the fate of DNA with regard to degradation and transformation capability in Bacillus subtilis［J］.Syst Appl Microbiol，2003，26(4):495－501.

［18］Carl W Dieffenbach，Gabriela S Dveksler.PCR Primer:A laboratorymanual［M］.Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995.

［19］邵國峰，蘭毅楠，曲晟，等.羊奶與牛奶比較有何優(yōu)缺點［J］.農(nóng)家之友，2009，272(13):75.

PCR method for the detection of allergen in milk

XU Qing－jin，DENG Zhi－rui，ZHANG Wen－ju，CHEN Qin*
(School of Life Sciences，Shanghai University，Shanghai 200444，China)

Milk is considered to be a kind of important allergen，and β－lactoglobulin is one major component of allergens in milk.A pair of primers was designed based on the gene sequence of β－lactoglobulin in milk and PCR reaction system was optimized for detecting β－lactoglobulin allergen.The results showed that best results could be obtained by combining 25ng template DNA with 4mmol/L primers used for PCR analysis.The established method can not only be successfully applied in detecting β－lactoglobulin allergen in milk from different shelf lives，and resources，but also in detecting the allergen in the mixture at different ratios of cow milk and goat milk.

β－lactoglobulin;PCR;milk allergen

TS207.3

A

1002－0306(2012)06－0104－04

2011－05－18 *通訊聯(lián)系人

許慶金(1984－)，男，在讀研究生，研究方向:食品安全檢測。