鄒月利，陶 波

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030)

固相萃取-高效液相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)大豆中氯嘧磺隆除草劑的殘留量

鄒月利，陶 波*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030)

實(shí)驗(yàn)建立了固相萃取－高效液相色譜－質(zhì)譜分析檢測(cè)方法，對(duì)大豆中氯嘧磺隆除草劑的殘留量進(jìn)行了研究。樣品經(jīng)甲醇－超聲波提取、正己烷液－液分配、固相萃取柱凈化，將處理好的樣品進(jìn)行液相色譜定量分析、采用液相色譜－質(zhì)譜進(jìn)行定性檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:氯嘧磺隆在0.1～200.0mg/L范圍內(nèi)濃度與峰面積具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9997(n=3);在2.0～100.0μg/kg范圍內(nèi)，加標(biāo)回收率為92.6%～95.2%;RSD為1.27%～2.64%;最低檢測(cè)限為10.0μg/kg(S/N=3)。本方法具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、凈化效果好等特點(diǎn)，適用于大豆中氯嘧磺隆除草劑的殘留分析檢測(cè)。

固相萃取，高效液相色譜－質(zhì)譜法，氯嘧磺隆除草劑，殘留檢測(cè)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆樣品 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供;甲醇、二氯甲烷 進(jìn)口色譜純;超純水 娃哈哈集團(tuán)有限公司;純度大于97.4%的氯嘧磺隆原藥 大連瑞澤農(nóng)藥有限公司;其它試劑均為分析純。

Agilent 1100型高效液相色譜儀、Agilent 1100 LC－MSD－TRAP型液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀 配有自動(dòng)進(jìn)樣器，紫外檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司;高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;R－205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生生物技術(shù)有限公司;KL512氮吹濃縮儀 東聯(lián)儀器設(shè)備有限公司;AL－104電子天平

瑞士梅特勒－托利多儀器公司;KQ500DV超聲波清洗儀 昆山超聲波儀器公司;TGL－16G離心機(jī)(最高轉(zhuǎn)速:16000r/min) 上海安亭儀器公司;AP－01P真空抽濾機(jī) 天津奧特賽恩斯儀器有限公司;0.45μm微孔濾膜 上海亞東公司;固相萃取柱:Sep－edTMC18;移液槍 德國(guó)公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1.1 色譜條件 采用Agilent－ZORBAX SB－C18色譜柱(4.6×150mm，5.0μm);檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm;柱溫為室溫;進(jìn)樣體積20.0μL;采用甲醇－水(pH2.5)=75∶25作為流動(dòng)相體系，流速為0.8mL/mim。

1.2.1.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧電離源(ESI);正(負(fù))離子掃描模式;質(zhì)量掃描范圍 100.0～1000.0amu;干燥氣流速 10.0L/min;干燥氣溫度335.0℃;霧化壓力 25.0psi。

1.2.2 大豆樣品的處理

1.2.2.1 粉碎 稱取約200g的大豆樣品，用粉碎機(jī)磨碎，混合均勻后備用。

1.2.2.2 提取 準(zhǔn)確稱取過篩后的大豆粉5.00g，置于50.0mL具塞離心管中，加入甲醇30.0mL，超聲波提取20.0min，用離心機(jī)離心15.0min(6000r/min)，將上清液轉(zhuǎn)移至250mL分液漏斗內(nèi)。重復(fù)3次，合并提取液;向上述提取液中加入30.0mL正己烷－甲醇飽和溶液，振蕩2min，靜置分層，棄去正己烷，重復(fù)3次。將甲醇層用真空抽濾機(jī)抽濾2次，去除大豆基質(zhì)，然后用250mL梨形瓶收集。置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上35℃，80.0r/min減壓濃縮至約1.0mL，最后用氮吹濃縮儀吹干，用6.0mL甲醇－水(乙酸調(diào)節(jié)pH2.5，體積比為 3∶7)溶解，待凈化處理［8］。

1.2.2.3 凈化 分別用2.0mL甲醇、2.0mL甲醇－水(乙酸調(diào)節(jié)pH2.5，體積比為3∶7)預(yù)淋洗C18固相萃取柱后，在Sep－edTMC18固相萃取柱中加入待凈化樣品，再向C18固相萃取柱內(nèi)加入2.0mL甲醇－水(乙酸調(diào)節(jié)pH 2.5，體積比為1∶1)，棄去淋出液。最后分三次共加入15.0mL甲醇－水(乙酸調(diào)節(jié)pH2.5，體積比為7∶3)，收集淋出液，離心 10.0min(12000r/min)，將上清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上35.0℃，80.0r/min減壓濃縮至約1.0mL，然后用氮吹濃縮儀吹干［9］。最后用甲醇溶解、定容至1.5mL，用0.45μm微孔濾膜過濾后用色譜儀進(jìn)行分析檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的選擇

實(shí)驗(yàn)考察了不同的流動(dòng)相及其配比:甲醇、甲醇－水、甲醇－水(pH2.5，用甲酸調(diào)節(jié))、甲醇－水(pH2.5，用36.0%的乙酸調(diào)節(jié))和甲醇－水(pH2.5，用85.0%的磷酸調(diào)節(jié))溶液作為流動(dòng)相體系。結(jié)果發(fā)現(xiàn):采用甲醇－水(pH2.5，用甲酸調(diào)節(jié))作為流動(dòng)相時(shí)，由于甲酸易揮發(fā)會(huì)對(duì)平行性和分離效果有影響;采用甲醇－水(pH2.5，用85.0%的磷酸調(diào)節(jié))溶液作為液相色譜的流動(dòng)相時(shí)基線平穩(wěn)，色譜峰尖銳，峰形對(duì)稱，分離效果較好。但是，由于流動(dòng)相里面有磷酸時(shí)會(huì)對(duì)液質(zhì)聯(lián)用儀有影響;采用甲醇－水(pH2.5，用36.0%的乙酸調(diào)節(jié))作為流動(dòng)相體系，流速為0.8mL/mim，甲醇∶水(pH2.5)=75∶25 時(shí)也能達(dá)到滿意的分離效果［10－12］。

2.2 提取溶劑的選擇

分別采用二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇－水、甲醇－水(pH2.5，用36.0%乙酸調(diào)節(jié))、甲醇－水(pH2.5，用85.0%的磷酸調(diào)節(jié))、甲醇和乙腈作為提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn):用二氯甲烷和乙酸乙酯提取樣品會(huì)出現(xiàn)不同程度的乳化現(xiàn)象，高速離心后，提取液仍渾濁不清;另外，用乙酸乙酯提取樣品后，大豆中的許多雜質(zhì)也同時(shí)被提取，干擾后續(xù)的分析。采用甲醇－水、甲醇－水(pH2.5，用36.0%乙酸調(diào)節(jié))和甲醇－水(pH2.5，用85.0%的磷酸調(diào)節(jié))的提取方式，均能使磺酰脲類除草劑從大豆基質(zhì)轉(zhuǎn)移到甲醇中，由于氯嘧磺隆在酸性介質(zhì)中不穩(wěn)定，容易分解;同時(shí)考慮到水的介入將增加后續(xù)凈化的步驟，選用甲醇和乙腈作為提取劑，提取率均在92.5%以上。由于乙腈成本較高，同時(shí)其毒性較大，所以選擇甲醇作為提取溶劑最適合［13－15］。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取純度為97.4%的氯嘧磺隆原藥0.1026g，用 250mL燒杯加入少量甲醇溶解，用500.0mL的容量瓶定容至刻度線，得到濃度為200.0mg/L氯嘧磺隆原藥儲(chǔ)備液。然后配制成濃度依次為 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、40.0、80.0、120.0、160.0、200.0mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.45μm微孔濾膜過濾后，按照1.2.1節(jié)色譜條件進(jìn)行液相色譜測(cè)定，得原藥的液相色譜圖(如圖1)，保留時(shí)間為8.519min。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線(如圖2)。結(jié)果得到回歸方程y=25.851x－2.137，相關(guān)系數(shù) r=0.9997(n=3)。表明對(duì)照品溶液0.1～200.0mg/L范圍內(nèi)線性良好，可以滿足定量分析的要求。

2.4 大豆樣品的測(cè)定

2.4.1 定量檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)對(duì)3個(gè)品種的大豆進(jìn)行處理，液相色譜檢測(cè)，進(jìn)樣量為20.0μL，得到大豆樣品的液相色譜圖(如圖3)，數(shù)據(jù)采用外標(biāo)法定量(如表1)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所測(cè)大豆粉中氯嘧磺隆的含量為12.7～16.3μg/kg。均低于美國(guó)和日本對(duì)大豆中氯嘧磺隆除草劑的最低殘留限量0.05mg/kg值。

圖1 氯嘧磺隆原藥的液相色譜圖Fig.1 The chromatogram of chlorimuron－ethyl original drug

圖2 氯嘧磺隆的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig.2 The standard working curve of chlorimuron－ethyl

圖3 大豆樣品的液相色譜圖Fig.3 The chromatogram of soybean sample

從圖3可以看出，樣品中氯嘧磺隆的保留時(shí)間為8.520min，和氯嘧磺隆原藥的保留時(shí)間基本一致，而且樣品中氯嘧磺隆與相鄰物質(zhì)的分離效果較好。

表1 3種大豆樣品中氯嘧磺隆的殘留量Table 1 The residual quantity of chlorimuron－ethyl in 3 kinds of soybean samples

2.4.2 定性分析 實(shí)驗(yàn)分別對(duì)3種大豆中提取的樣品做HPLC－MS分析檢測(cè)(如圖4、圖5)。同時(shí)根據(jù)質(zhì)譜圖解析方法:a.同位素峰，比如含氯的化合物。b.加合離子，比如加鈉的就是M+23的峰，或者是自身加合的2M+1，或者2M+23的峰等。c.斷裂碎片，離子在源內(nèi)發(fā)生斷裂，產(chǎn)生碎片被檢測(cè)到。d.還有些化合物會(huì)脫水。e.基質(zhì)或者流動(dòng)相的干擾，在相同條件下被檢測(cè)到等等［16］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，圖4:414.9為M+1，436.8 為 M+23，458.7 為 M+46;圖5:413.1 為M－1(M為氯嘧磺隆分子量，Na的分子量為23)。因此，從質(zhì)譜數(shù)據(jù)可以進(jìn)一步對(duì)樣品中的氯嘧磺隆除草劑進(jìn)行定性。

圖4 樣品中氯嘧磺隆的質(zhì)譜圖(+MS)Fig.4 The mass spectrogram(+MS)of chlorimuron－ethyl in soybean sample

圖5 樣品中氯嘧磺隆的質(zhì)譜圖(－MS)Fig.5 The mass spectrogram(－MS)of chlorimuron－ethyl in soybean sample

2.5 方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

取同一供試樣品溶液，按照1.2節(jié)建立的方法進(jìn)樣分析，分別在0、24、48h測(cè)定峰面積，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.43%～2.64%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，供試品溶液在48h內(nèi)基本穩(wěn)定。然后分別準(zhǔn)確稱取同一大豆粉樣品3份均5.0g，樣品按1.2.2節(jié)方法處理，按照1.2.1節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定氯嘧磺隆含量分別為 12.5、12.6、12.7μg/kg，平均含量為 12.6μg/kg，RSD為0.79%(n=3)。結(jié)果表明，方法重現(xiàn)性好。

2.6 方法的精密度和回收率

取同一供試樣品溶液，按1.2.1節(jié)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣3次，測(cè)定氯嘧磺隆含量分別為13.3、13.5和13.7μg/kg平均值為13.5μg/kg，RSD 為 1.05%(n=3)，表明該方法精密度很高。然后向大豆空白樣品中添加不同濃度的氯嘧磺隆除草劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.2節(jié)樣品處理方法制備供試品溶液，按照1.2.1節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析，加標(biāo)回收率92.6%～95.2%，RSD為1.27% ～2.39%。

2.7 方法的最小檢測(cè)限

實(shí)驗(yàn)采用2～3倍噪聲為最小響應(yīng)值，對(duì)3種大豆樣品種中氯嘧磺隆除草劑殘留量進(jìn)行檢測(cè)，方法的最低檢出限均低于10.0μg/kg(S/N=3)，可以滿足最低殘留限量的檢測(cè)要求。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)采用了以甲醇作溶劑、超聲波提取、正己烷液－液分配、Sep－edTMC18固相萃取柱凈化，建立了大豆中氯嘧磺隆殘留量的高效液相色譜－質(zhì)譜測(cè)定方法。本測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、凈化效果好、靈敏度高等特點(diǎn)，可用于大豆中氯嘧磺隆殘留量的定性與定量的分析檢測(cè)。

［1］祁彥，占春瑞，張新忠，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定大豆中10種磺酰脲類除草劑的殘留量［J］.色譜，2004，22(6):634－638.

［2］Blasco C，F(xiàn)ont G，Manes J，et al.Screening and evaluation of fruit samples for four pesticide residues［J］.J AOAC Int，2005，88(3):847－853.

［3］祁彥，李淑娟，占春瑞，等.高效液相色譜－質(zhì)譜法測(cè)定大豆中磺酰脲類除草劑多殘留量的研究［J］.分析化學(xué)，2004，32(11):1421－1425.

［4］Obana H，Okihashi M，Akutsu K，et al.Determination of neonicotinoid pesticide residues in vegetables and fruits with solid phase extraction and liquid chromatography mass spectrometry［J］.J Agric Food Chem，2003，51(9):2501－2505.

［5］趙永剛，張祥志，胡冠九，等.固相萃?。咝б合嗌V法測(cè)定地表水中磺酰脲類農(nóng)藥的研究［J］.分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2008，24(3):287－290.

［6］葉貴標(biāo)，張微，崔昕.高效液相色譜－質(zhì)譜法測(cè)定土壤中10種磺酰脲類除草劑多殘留［J］.分析化學(xué)，2006，34(9):1207－1212.

［7］王和興，黎源倩，雍莉，等.固相萃?。咝б合嗌V法同時(shí)測(cè)定大豆和大米中的磺酰脲類和二苯醚類除草劑殘留［J］.色譜，2007，25(4):536－540.

［8］Lentza－ Rizos C，Avramides E J，Visi E.Determination of residues of endosulfan and five pyrethroid insecticides in virgin of olive oil using gas chromatography with electron－captyre detetion［J］.J Chromatogr A，2001，921(2):297－304.

［9］趙進(jìn)英，辛暨華，郭英娜，等.固相萃取富集－高效液相色譜法分離檢測(cè)水中3種苯脲除草劑［J］.分析化學(xué)，2004(7):103－106.

［10］郝征紅.固相萃取－HPLC技術(shù)在農(nóng)藥殘留分析中的研究與應(yīng)用［D］.濟(jì)南:山東師范大學(xué)，2006.

［11］隋凱，李軍，衛(wèi)鋒，等.固相萃?。咝б合嗌V法同時(shí)檢測(cè)大米中12種磺酰脲類除草劑的殘留［J］.色譜，2006，24(2):152－156.

［12］祁彥，張新忠，占春瑞，等.高效液相色譜法測(cè)定大豆中磺酰脲類除草劑的殘留［J］.農(nóng)藥，2005，44(2):76－78.

［13］Brown H M.Modes of action，crop selectivity，and soil relations of the sulfonylures herbicides［J］.Pestic Sci，1987，29(3):263－281.

［14］Martel A C，Zeggane S.Determination of acaricides in honey by high－performance liquid chromatography with photodiode array detection［J］.J Chromatogr A，2002，954:173－180.

［15］任晉，黃翠玲，趙國(guó)棟，等.固相萃?。咝б合嗌V－質(zhì)譜聯(lián)機(jī)在線分析水中痕量除草劑［J］.分析化學(xué)，2001(8):876－880.

［16］Rastrelli L，Totaro K，Simone F D.Determination of organophosphorus pesticide residues in Cilento(Campania，Italy)virgin olive oil by capillary gas chromatography［J］.Food Chem，2002，79:303－305.

Determination of chlorimuron－ethyl residue in soybean by solid phase extraction－h(huán)igh performance liquid chromatography－mass spectrometry

ZOU Yue－li，TAO Bo*
(College of Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

A solid phase extraction－h(huán)igh performance liquid chromatography－mass spectrometry method was established for determination the residue of chlorimuron－ethyl herbicide in soybean.Samples were extracted by methanol with ultrasonic，then liquid－liquid partitioned with normal hexane and purified by solid phase extraction.The sample was quantitatively analyzed by high performance liquid chromatography and qualitatively analyzed by high performance liquid chromatography－mass spectrometry.Results showed that:a good linear range from 0.1～200.0mg/L with correlation coefficient of above 0.9997(n=3)was obtained.The extraction recovery were 92.6%～95.2%and the relative standard deviation were 1.27%～2.64%.The limit of detection was 10.0μg/kg(S/N=3).The described method was simple，sensitive and accurate.

solid phase extraction;high performance liquid chromatography－mass spectrometry;chlorimuron－ethyl herbicide;residue detection

TS207.3

A

1002－0306(2012)17－0291－04

2012－02－27 *通訊聯(lián)系人

鄒月利(1980－)，男，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向:農(nóng)藥降解及殘留分析。

哈爾濱市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(2007GG002544)。