王 光，鐘杰平，劉華忠

(1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江 524088;2.廣東海洋大學理學院，廣東湛江 524088;3.廣東海洋大學生物化學中心，廣東湛江 524088)

烏賊墨多糖緩解環(huán)磷酰胺致大鼠骨髓功能抑制作用的研究

王 光1，鐘杰平2，劉華忠3，*

(1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江 524088;2.廣東海洋大學理學院，廣東湛江 524088;3.廣東海洋大學生物化學中心，廣東湛江 524088)

探討烏賊墨多糖(SIPS)對環(huán)磷酰胺所致骨髓功能抑制的緩解效應。以SD大鼠為模型，灌服SIPS和腹腔注射環(huán)磷酰胺共處理，檢測大鼠外周血像和骨髓DNA含量。環(huán)磷酰胺不僅顯著降低了大鼠外周血紅細胞、白細胞和血小板的數(shù)量以及血紅蛋白的含量，骨髓細胞DNA含量也被顯著下調(diào)(p＜0.01 or p＜0.05)。SIPS十分明顯的弱化了該化療藥物的骨髓抑制功能，環(huán)磷酰胺對以上指標參數(shù)所導致的負效應均被該海洋活性物質(zhì)不同程度的消減(p＜0.05 or p＜0.01)。SIPS可緩解環(huán)磷酰胺所致大鼠骨髓造血功能抑制作用。

烏賊墨多糖，環(huán)磷酰胺，骨髓抑制，大鼠

當前盡管已有多種腫瘤治療措施被相繼創(chuàng)立，但臨床上化療依然是最常采用的治療手段，環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CP)就是其中一種廣泛被使用的抗腫瘤藥物。作為一種氮芥類抗腫瘤藥物，CP在肝臟微粒體細胞色素P－450酶系代謝活化［1］。研究表明，高劑量CP通過損傷細胞的結(jié)構(gòu)與功能而誘導免疫抑制［1］、心臟毒性［2］、肺毒性［3］和骨髓功能抑制［4］等，因此，因其細胞毒性而導致化療藥物的臨床應用受到了限制，結(jié)果使得癌癥治療效果顯著下降。因而，用于腫瘤臨床化療上的細胞保護劑的篩選與應用迫在眉睫。多糖已被廣泛認為是一類多功能的

生物活性物質(zhì)，天然多糖根據(jù)來源不同可分為植物多糖、動物多糖和微生物多糖。目前，大約300多種天然多糖已被分離鑒定，其中大部分被證實具有生物學活性。隨著海洋生物技術(shù)的發(fā)展以及對海洋天然活性物質(zhì)的研究的增多，源自海洋生物的多糖正成為科學界的研究熱點。這其中，烏賊墨多糖(squid ink polysaccharides，SIPS)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種海洋多糖，分離于烏賊墨汁。大量的研究結(jié)果證實，烏賊墨不僅具有抗腫瘤［5］、抗氧化［6］、抗菌［7－8］、升白［9］等生物學活性，而且能保護小鼠骨髓和脾臟，弱化環(huán)磷酰胺對造血功能造成的損傷［4］。雖然先前的研究發(fā)現(xiàn)，烏賊墨對CP所致正常組織器官的毒性損傷具有緩解效應［3－4，10］，但因為烏賊墨是一種混合物，包含有色素、蛋白、脂類和多糖等。為篩選其化療保護有效成分，本研究制備了SIPS，并和環(huán)磷酰胺共刺激大鼠，以大鼠的骨髓功能為評價指標，確證SIPS的化療保護功效。

1 材料與方法

1.1 SIPS的制備

SIPS 的制備方法參考先前的報道［11－12］。

1.2 實驗設計

體重相近(155±10)g的10周齡健康SD大鼠適應性馴養(yǎng)1周后開始接受實驗處理。動物房溫度為(26±2)℃，相對濕度為44%～45%，光暗周期為10h與14h。動物隨機均分為8組，10只/組，雌雄各半。對照組(A)全實驗期(15d)灌服生理鹽水，于第6d和7d腹腔注射生理鹽水兩次;模型組(B)分別于實驗第6d和7d兩次腹腔注射CP(100mg/kg，溶于生理鹽水)，全程灌服生理鹽水;C、D組為SIPS和CP共處理組，該兩組大鼠全程分別灌服SIPS，劑量分別為60、120mg/kg(1次/d)，并且于第6、7d腹腔注射腹腔注射CP。整個實驗期為15d，第16d處死大鼠，進行實驗指標檢測。

1.3 外周血像檢測

大鼠摘眼球取血，抗凝，血細胞自動分析儀檢測紅細胞、白細胞和血小板數(shù)量，以及血紅蛋白含量。

1.4 骨髓DNA含量檢測［4］

剝離小鼠左側(cè)后肢股骨，用眼科手術(shù)剪將股骨兩端剪斷，露出骨髓腔。用10mL 0.005mol/L CaCl2沖洗骨髓至離心管中，4℃冰箱放置30min，2500r/min離心15min。棄上清，加入0.2mol/L HClO4溶液5mL，振蕩混勻后，90℃加熱15min。快速冷卻至室溫，冷卻后過濾，紫外分光光度計測定268nm的吸光度值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(ˉX±S)表示，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0軟件進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外周血像

數(shù)據(jù)結(jié)果詳見圖1。相較于空白對照組，CP(100mg/kg)處理導致了大鼠外周血中紅細胞、白細胞和血小板數(shù)量以及血紅蛋白含量顯著下降(p＜0.01)。然而在SIPS和CP共處理組中，這四個參數(shù)卻出現(xiàn)了比模型組明顯的不同程度的提升，白細胞和血小板數(shù)量均顯著高于模型組(p＜0.05或p＜0.01)，對于紅細胞和血紅蛋白，明顯的變化見于SIPS 120mg/kg劑量組(p＜0.05)。

2.2 骨髓DNA含量

為進一步探討SIPS對CP誘導的骨髓功能抑制的作用效果，本實驗檢測了骨髓細胞DNA含量，數(shù)據(jù)詳見圖2。結(jié)果顯示，盡管CP顯著下調(diào)了大鼠骨髓細胞DNA含量(p＜0.01)，但該下降趨勢卻被SIPS所抑制，其最終錨定的數(shù)據(jù)值明顯高于CP單獨處理的模型組大鼠(p＜0.05)。結(jié)果表明，SIPS能明顯改善CP對大鼠骨髓DNA的損傷，抑制骨髓有核細胞的減少，緩解CP對骨髓造血功能的毒性損傷。

3 討論

圖1 SIPS對環(huán)磷酰胺致大鼠外周血像變化的影響(n=10)Fig.1 Effect of SIPS on peripheral blood profile changes induced by CP in rats(n=10)

圖2 SIPS對環(huán)磷酰胺致大鼠骨髓細胞DNA含量變化的影響(n=10)Fig.2 Effect of SIPS on CP－indeced changes of DNA content in bone marrow from rats(n=10)

骨髓是人體最大的造血器官。造血干細胞是生成各種血細胞的原始細胞，具有很強的分裂增殖潛能，其在一定的微環(huán)境和某些因素的調(diào)節(jié)下增殖分化為各類血細胞的造血祖細胞。血細胞發(fā)生是造血干細胞經(jīng)增殖、分化直至成為各種成熟血細胞的過程。當機體受到某些外部因素的攻擊，如化療和放射，造血干細胞和造血祖細胞的增殖均將受到嚴重抑制。環(huán)磷酰胺是一種被臨床上廣泛使用的抗腫瘤藥物，其作用靶標為細胞快速分裂增殖組織或器官，因而，除兼?zhèn)洳凰佬?、轉(zhuǎn)移性和無接觸抑制性等特征的腫瘤細胞之外，尤其是對增殖活躍的骨髓造血干細胞作用特別強，主要破壞細胞DNA的結(jié)構(gòu)和功能，從而影響骨髓造血干細胞的增殖、分化并抑制骨髓造血功能。

環(huán)磷酰胺誘導線粒體發(fā)生氧化應激，產(chǎn)生活性氧(ROS)，啟動下游多種反應程序，導致氧化—抗氧化平衡向氧化方向傾斜，損傷生物高分子(如DNA、蛋白質(zhì))，導致細胞凋亡［13］。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，環(huán)磷酰胺顯著下調(diào)了外周血紅細胞、白細胞和血小板數(shù)量以及血紅蛋白和骨髓DNA含量，表明環(huán)磷酰胺所致大鼠骨髓損傷模型構(gòu)建成功。

SIPS為從烏賊墨中分離制備的多糖，背景研究已經(jīng)揭示SIPS分子為帶有分支結(jié)構(gòu)的糖胺聚糖，主鏈為葡萄糖醛酸—海藻糖(GlcA－Fuc)二糖單元的串聯(lián)重復，N－乙酰半乳糖胺(GalNAc)分支于海藻糖，完整的三糖重復單元為{－3GlcAβ1－4(GalNAcα1－3)Fucα1－}n［14－15］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SIPS 能顯著改善環(huán)磷酰胺對大鼠外周血像和骨髓DNA含量造成的負面影響，本文所示兩個劑量組中，高劑量組的保護效果明顯優(yōu)于低劑量組，而且，與本課題組前期報道的180mg/kg 的最高劑量組比較［16］，120mg/kg 劑量依然稍強，因此，在我們所做的60、120、180mg/kg三個劑量組中，120mg/kg為最適宜劑量。結(jié)果表明，SIPS能顯著緩解環(huán)磷酰胺對大鼠骨髓造血功能所造成的抑制作用。

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Study on squid ink polysaccharides weakens the suppression of bone marrow induced by cyclophosphamide in rats

WANG Guang1，ZHONG Jie－ping2，LIU Hua－zhong3，*
(1.College of Food Science ＆ Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China;2.College of Science，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China;3.Modern Biochemistry Center，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China)

In orderto explore the amelioratory effects ofsquid ink polysaccharides(SIPS)towards cyclophosphamide－induced suppression of bone marrow functions.Sprague－Dawley rats were employed to be co－treated with intraperitoneal cyclophosphamide and oral SIPS.Peripheral blood profile and DNA content in bone marrow were detected.Cyclophosphamide decreased significantly the quantities of erythrocytes，leukocytes and platelets in blood，contents of hemoglobin in blood and DNA in bone marrow(p ＜0.01 or p ＜0.05).SIPS incoordinately impaired the negative changes induced by cyclophosphamide(p＜0.05 or p＜0.01).It was implied that SIPS could protect bone marrow from chemotherapeutical damage caused by cyclophosphamide.

squid ink polysaccharides;cyclophosphamide;suppression of bone marrow;rats

TS254.9

A

1002－0306(2012)17－0365－03

2012－01－12 *通訊聯(lián)系人

王光(1983－)，男，碩士研究生，主要從事海洋生物活性物質(zhì)研究。

國家自然科學基金(31171667)。