劉 鄧，丁 飛，侯瑞霞，徐振林，孫遠(yuǎn)明，楊金易，*

(1.廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642;2.國(guó)家肉制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(漯河)，河南漯河 462000)

恩諾沙星化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒的研制

劉 鄧1，丁 飛2，侯瑞霞1，徐振林1，孫遠(yuǎn)明1，楊金易1，*

(1.廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642;2.國(guó)家肉制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(漯河)，河南漯河 462000)

主要研制一種基于魯米諾－辣根過氧化物酶體系的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，用于檢測(cè)食品中的痕量恩諾沙星殘留。反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果為:最佳包被抗原濃度為0.5ng/mL，最佳抗體稀釋倍數(shù)為1∶2000，藥物稀釋液為0.01mol/L的PBST溶液，一抗反應(yīng)時(shí)間為30min。研究結(jié)果顯示:本文研制的試劑盒的回歸曲線方程是y=－22842x+172936，檢測(cè)線性范圍是0.024～2.76ng/mL，IC50為0.106ng/mL，對(duì)蜂蜜、牛奶、魚肉和蝦肉樣本的添加回收率在96%～116%、90%～97%、92%～112%、86%～112%之間，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于15%，試劑盒在4℃下有效期為180d。

恩諾沙星，化學(xué)發(fā)光免疫分析，試劑盒

恩諾沙星(Enrofloxacin，ENR)屬于第三代氟喹諾酮類(Fluoroquinolones，F(xiàn)Qs)藥物中的一種，廣泛應(yīng)用于動(dòng)物和人類多種感染性疾病的治療［1］。但是，隨著恩諾沙星在養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中的廣泛應(yīng)用，其藥物殘留問題已引起廣泛的關(guān)注，恩諾沙星在動(dòng)物源食品中的殘留可引起神經(jīng)中毒、腎功能損傷、過敏反應(yīng)等毒副作用，并且容易誘使人類致病菌產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致體內(nèi)環(huán)境中耐藥性菌株的增加，從而使該類藥物在人類疾病的治療中產(chǎn)生耐藥性［2－5］。食品中恩諾沙星殘留的檢測(cè)方法主要分為儀器檢測(cè)法和免疫分析法兩大類。儀器檢測(cè)法主要包括有高效液相色譜法、液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法等，這些方法對(duì)待測(cè)樣品前處理要求高，操作繁瑣，所需儀器昂貴，不適合大批量的篩選檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)［6－7］。免疫分析法則包括酶聯(lián)免疫分析、時(shí)間分辨熒光免疫分析和化學(xué)發(fā)光免疫分析等多種方法。該類方法具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，能適應(yīng)大量樣品的快速檢測(cè)等特點(diǎn)。根據(jù)報(bào)道，陳雪嵐等［8］研制的恩諾沙星酶聯(lián)免疫分析試劑盒的IC50是10ng/mL，趙莉莉等［9］建立的恩諾沙星時(shí)間分辨分析方法的IC50是3.4ng/mL。近年來，隨著人們食品安全意識(shí)的逐漸增強(qiáng)，人們對(duì)有害物質(zhì)殘留的檢測(cè)要求也越來越高，因此建立靈敏度更高的檢測(cè)方法成為研究熱點(diǎn)之一。化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法是一種新型的免疫分析方法之一，該方法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)不需要外界光源，減少了背景干擾，可以進(jìn)一步提高恩諾沙星殘留檢測(cè)的靈敏度，主要用于有害物的痕量和超痕量的檢測(cè)［10－13］。本文在合成人工抗原及制備多克隆抗體的研究基礎(chǔ)上，基于魯米根過氧化物酶體系(HRP－Luminol－H2O2system)，研制恩諾沙星化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，為恩諾沙星殘留檢測(cè)提供一種新的參考方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

99.5%恩諾沙星 浙江國(guó)邦藥業(yè)有限公司;HRP標(biāo)記羊抗兔IgG 武漢博士德生物工程有限公司;恩諾沙星－卵清白蛋白偶聯(lián)物(ENR－OVA)、恩諾沙星多克隆抗體 本實(shí)驗(yàn)室提供;恩諾沙星ELISA試劑盒 廣州萬聯(lián)生物科技有限公司;乙腈 色譜純，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。包被緩沖溶液:1.69g Na2CO3，2.95g NaHCO3加去離子水定容至 1000mL;洗滌緩沖液:3.0g Na2HPO4·12H2O，8.0g NaCl，0.6mL Tween－20加蒸餾水定容至1000mL;封閉液:5g脫脂奶粉加去離子水定容至100mL;0.01mol/L PBST溶液:8.5g NaCl，2.9g Na2HPO4·12H2O，0.9g KH2PO4，0.9g KCl，0.6mL Tween－20，去離子水定容至 1000mL;0.01mol/L的T液:取0.2mol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)與0.2mol/L的 HCl溶液混合，再加入0.1%BSA和0.04%NaN3;CLEIA底物液 A:Luminol－Na 4mg溶于20mL 0.1mol/L的T液中;CLEIA底物液B:2mg對(duì)碘酚溶于100μL二甲基亞砜(DMSO)，加入4μL 3%的雙氧水(H202);1mg/mL恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品工作液:稱取50mg恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品，溶于50mL的無水甲醇中。

Wellwash MK2洗板機(jī) 美國(guó) Thermo公司;6K－15高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sartorius公司;Wallac VITOR31420多標(biāo)記分析儀 美國(guó)PE公司;微量移液器 美國(guó)Eppendorf公司;高效液相色譜儀 Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 恩諾沙星icCLEIA檢測(cè)方法的建立

1.2.1.1 恩諾沙星icCLEIA檢測(cè)基本步驟 將包被原用包被緩沖液稀釋成合適的濃度，100μL/孔加入化學(xué)發(fā)光板孔中，置于37℃孵育箱中孵育12h，取出化學(xué)發(fā)光板，用洗板機(jī)洗2次，拍干，每孔加入120μL封閉液，置于37℃孵育箱中封閉3h，甩干孔中液體，放置在37℃烘箱中烘1h，備用。

將恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品工作液稀釋為0、0.01、0.03、0.09、0.27、0.81、2.43、7.29ng/mL 8 個(gè)梯度，取50μL 各梯度標(biāo)準(zhǔn)品到包被好的板條中，加入50μL稀釋好的抗體，在25℃條件下反應(yīng)一段時(shí)間，用洗板機(jī)洗6次。

每孔加入100μL用T液稀釋10000倍的酶標(biāo)二抗，在25℃條件下反應(yīng)20min，用洗板機(jī)洗6次。

然后取等量的化學(xué)發(fā)光液A與B混合均勻后，將一定量的化學(xué)發(fā)光液加入到洗好的板條中，反應(yīng)一定的時(shí)間，讀數(shù)。

1.2.1.2 icCLEIA反應(yīng)條件的優(yōu)化 根據(jù)以上檢測(cè)步驟優(yōu)化icCLEIA免疫反應(yīng)體系中的包被原濃度、一抗稀釋倍數(shù)、藥物稀釋液、免疫反應(yīng)時(shí)間確定免疫反應(yīng)工作條件;優(yōu)化發(fā)光反應(yīng)中發(fā)光液添加量、發(fā)光反應(yīng)時(shí)間確定發(fā)光反應(yīng)工作條件。

1.2.1.3 icCLEIA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以恩諾沙星濃度的對(duì)數(shù)值lgC為橫坐標(biāo)，各稀釋度發(fā)光計(jì)數(shù)RLU為縱坐標(biāo)，按照RLU－lgC四參數(shù)對(duì)數(shù)擬合繪制恩諾沙星icCLEIA方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出該方法的半抑制濃度(IC50)和線性范圍(IC20～I(xiàn)C80)。

1.2.2 試劑盒組建 根據(jù)以上優(yōu)化條件組建試劑盒，確定試劑盒的組成和檢測(cè)步驟。

1.2.3 添加回收實(shí)驗(yàn) 選取蜂蜜，液態(tài)牛奶，魚肉，蝦肉作為添加回收實(shí)驗(yàn)樣本。其前處理方法如下:

蜂蜜:稱取3份樣品每份1g置于3個(gè)15mL離心管中，分別添加1、5、10ng標(biāo)準(zhǔn)品于樣品中，放置10min后分別加入4mL蒸餾水，充分振蕩均勻，再加入4mL乙酸乙酯，振蕩20min，用離心機(jī)以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，吸取上層乙酸乙酯層2mL置于雞心瓶中用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸至干。加入1mL正己烷溶解干燥物，再加入1mL去離子水復(fù)溶，去除上層正己烷層，取下層清液50μL待測(cè)。

肌肉組織:稱取均質(zhì)后肌肉組織3份，每份各1g置于3個(gè)15mL離心管中，分別添加1、5、10ng標(biāo)準(zhǔn)品，靜置10min后分別加入4mL去離子水，充分振蕩均勻，然后用離心機(jī)以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，分別吸取上層清液2mL于3個(gè)10mL離心管中，加入2mL正己烷，振蕩10min，以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，除去上層正己烷層，取下層清液50μL待測(cè)。

牛奶:吸取牛奶樣品3份，每份1g置于3個(gè)15mL離心管中，每管牛奶樣品分別添加1、5和10ng的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品，充分振蕩均勻，靜置10min。加入6mL乙腈，用去離子水定量到10mL。振蕩20min，用離心機(jī)以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，分別各取上層清液5mL于雞心瓶中用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸至干，加入1mL正己烷溶解干燥物，再加入1mL去離子水復(fù)溶，除去上層正己烷，取下層清液50μL待測(cè)。

樣本經(jīng)前處理后，用研制的試劑盒進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出添加的恩諾沙星濃度、添加回收率與變異系數(shù)。

1.2.4 試劑盒性能評(píng)價(jià)

1.2.4.1 精密性實(shí)驗(yàn) 以批內(nèi)變異和批間變異衡量試劑盒的精密度。在添加回收實(shí)驗(yàn)中，取同一批次包被板，對(duì)同批樣品同種樣品進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算批內(nèi)變異，得到同批樣品中同種樣品的精密度。對(duì)不同批樣品中同種樣品進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算批間變異，得到不同批次樣品中同種樣品的精密度。計(jì)算公式為:

1.2.4.2 特異性實(shí)驗(yàn) 將恩諾沙星與環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、加替沙星、氯霉素、萊克多巴胺等類似物按相同倍比稀釋，按照恩諾沙星icCLEIA檢測(cè)步驟，在相同條件下分別作分析物及其類似物的競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，計(jì)算其類似物對(duì)恩諾沙星多克隆抗體的交叉反應(yīng)率和IC50。

1.2.4.3 保存期實(shí)驗(yàn) 將試劑盒置于4℃環(huán)境中，保存6個(gè)月，每個(gè)月測(cè)定一次，置于37℃環(huán)境中，保存5d，每天測(cè)定一次。分別測(cè)定零標(biāo)準(zhǔn)品的發(fā)光值B0和50%藥物抑制濃度對(duì)應(yīng)的化學(xué)發(fā)光值B，計(jì)算二者的比值B/B0。當(dāng)B/B0＞0.7時(shí)，即可判定試劑盒已失效［14］。在37℃放置1d相當(dāng)于在4℃放置45d，經(jīng)過換算可確定CLEIA試劑盒的保存期。

采用Waters高效液相色譜儀，檢測(cè)條件是:檢測(cè)器采用紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，流動(dòng)相流速為1.0mL/min，進(jìn)樣量設(shè)為20μL，柱溫為25℃。色譜柱采用Atlantis C18色譜柱(長(zhǎng)度160mm×4.6mm，粒徑5.0μm)。流動(dòng)相為:磷酸溶液/三乙胺(0.05mol/L，pH2.4)+乙腈=82+18。

1.2.4.5 HPLC，ELISA，CLEIA三種方法性能對(duì)比采用商品化恩諾沙星ELISA試劑盒，參考試劑盒說明書，繪制出恩諾沙星ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線并求出其IC50，比較三種方法的靈敏性。

2 結(jié)果與分析

2.1 icCLEIA反應(yīng)條件的優(yōu)化

對(duì)包被原濃度、一抗稀釋倍數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液、一抗反應(yīng)時(shí)間等免疫反應(yīng)工作條件進(jìn)行優(yōu)化(圖1a～圖1d)，通過比較RLUmax/IC50的值大小(值越大方法的檢測(cè)效果越好)，確定了icCLEIA最佳免疫反應(yīng)條件［16］:即包被濃度5ng/mL，抗體稀釋倍數(shù)為1∶2000，抗體反應(yīng)時(shí)間 30min，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為0.01mol/L PBST溶液;對(duì)發(fā)光液添加量、添加發(fā)光液后到放入發(fā)光儀讀數(shù)之間間隔的時(shí)間等發(fā)光反應(yīng)工作條件進(jìn)行優(yōu)化(圖1e～圖1f)，確定發(fā)光反應(yīng)最佳工作條件:發(fā)光液添加量為100μL，添加后3～5min之內(nèi)讀數(shù)。

2.2 icCLEIA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)優(yōu)化的條件按照檢測(cè)步驟進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)梯度做5個(gè)平行。根據(jù)所得的數(shù)據(jù)，以恩諾沙星濃度的對(duì)數(shù)值lgC為橫坐標(biāo)，各稀釋度發(fā)光計(jì)數(shù)RLU為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得曲線如圖2所示。其回歸曲線方程為 y=－22842x+172936，R2=0.9912。經(jīng)計(jì)算得該方法檢測(cè)的線性范圍是0.024～2.76ng/mL，IC50是 0.106ng/mL。

2.3 試劑盒的組建

2.3.1 試劑盒組成 試劑盒的組成如表1所示。

[43]Joshua R. Loftus, et al., “Causal Reasoning for Algorithmic Fairness”, May. 15, 2018, https://arxiv.org/abs/1805.05859.

表1 試劑盒的組成Table 1 The composition of the CLEIA kit

2.3.2 檢測(cè)方法 取出試劑盒，于室溫(25℃左右)平衡20min。取出化學(xué)發(fā)光板，將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品按每孔50μL依次加入到空白微孔中，做兩個(gè)平行。在以上各孔中每孔加入50μL的恩諾沙星抗體，放入孵育箱中于37℃下孵育30min。將濃縮洗液稀釋100倍，每孔加入220μL，充分洗滌5次，然后用吸水紙拍干。每孔加入100μL的酶標(biāo)記物，放入孵育箱中于37℃下孵育15min，用洗液洗滌5次，用吸水紙拍干。將化學(xué)發(fā)光A液和B液等量混勻，每孔加入100μL，加入后3～5min內(nèi)在化學(xué)反光儀上讀出各孔的化學(xué)發(fā)光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品各孔的讀數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品各孔的讀數(shù)確定恩諾沙星的含量。

圖1 不同工作條件對(duì)icCLEIA靈敏度的影響Fig.1 Influence of different conditions on sensitivity of icCLEIA

表3 恩諾沙星類似物的交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)Table 3 Cross－reactivity test of NER analogues

表4 保存期實(shí)驗(yàn)Table 4 Storage period of the experiment

圖2 ENR的icCLEIA標(biāo)準(zhǔn)曲線(n=5)Fig.2 Standard curve of icCLEIA for ENR(n=5)

2.4 添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用上述化學(xué)發(fā)光方法，對(duì)蜂蜜、牛奶、蝦肉、魚肉進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)添加濃度水平做5個(gè)平行，結(jié)果顯示(見表2):蜂蜜樣品的平均回收率為96%～116%，牛奶樣品的回收率為90%～97%，蝦肉樣品的平均回收率為92%～112%，魚肉樣品的回收率為86%～112%。

表2 蜂蜜、牛奶、蝦肉、魚肉樣品添加回收實(shí)驗(yàn)(n=5)Table 2 Recovery test results with honey，milk，shrimp and fish as samples(n=5)

2.5 精密性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

方法對(duì)批內(nèi)變異和批間變異見表2。由結(jié)果得出，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于15%，對(duì)實(shí)際樣品檢測(cè)的精密度符合要求。

2.6 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

恩諾沙星結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，所用的恩諾沙星抗體特異性好，與環(huán)丙沙星和氧氟沙星的交叉反應(yīng)率分別為1.43%和1.08%，與其他結(jié)構(gòu)類似物和功能類似物的交叉反應(yīng)率均小于0.1%。

2.7 保存期實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果如表4所示，在4℃環(huán)境中，保存6個(gè)月以內(nèi)，B/B0值均小于0.7，說明試劑保存狀態(tài)良好。由4℃和37℃實(shí)驗(yàn)得出，恩諾沙星試劑盒在4℃狀態(tài)下至少能保存6個(gè)月。

2.8 相關(guān)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用HPLC方法，所得的結(jié)果為:目標(biāo)峰形如圖3所示，得到恩諾沙星保留時(shí)間為13.70min;繪制恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線在10～1000ng/mL范圍內(nèi)保持線性關(guān)系，回歸曲線為y=158000x－216，R2=0.999530。

圖3 恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液(500ng/mL)HPLC圖Fig.3 The HPLC fig of enrofloxacin standard solution(500ng/mL)

采用HPLC方法，對(duì)蜂蜜、牛奶、魚肉、蝦肉進(jìn)行檢測(cè)，分別于50、100、250ng/g三個(gè)濃度水平做添加回收實(shí)驗(yàn)，得出HPLC法添加回收數(shù)據(jù)。將經(jīng)過前處理后此三個(gè)濃度水平的樣品用0.01mol/L的PBST溶液稀釋50倍，再用研制的CLEIA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度做5個(gè)平行，得到CLEIA法添加回收實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)乘以50后與HPLC法實(shí)驗(yàn)結(jié)果做比較，得出的HPLC和CLEIA相關(guān)性如圖5所示，由相關(guān)性分析得到擬合直線的相關(guān)系數(shù)R2=0.9961，斜率約為1，說明HPLC與CLIEA檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性符合要求。

2.9 HPLC，ELISA，CLEIA 性能對(duì)比

三種恩諾沙星殘留檢測(cè)方式的性能比較見表7:本文研制的CLEIA試劑盒的IC50最低，靈敏度最好。根據(jù)新聞報(bào)道，日本在2009年將動(dòng)物類食品恩諾殘留限量標(biāo)準(zhǔn)調(diào)整至10ppb，由于一些動(dòng)物組織如肝臟、貝類等經(jīng)過前處理后會(huì)存在嚴(yán)重的基質(zhì)效應(yīng)，要再經(jīng)過稀釋10～20倍進(jìn)行檢測(cè)。而經(jīng)過稀釋后樣本中恩諾沙星的濃度如果偏離恩諾沙星ELISA試劑盒的檢測(cè)范圍，就會(huì)影響恩諾沙星ELISA試劑盒檢測(cè)的準(zhǔn)確度［11］。而本文研制的恩諾沙星CLEIA試劑盒其檢測(cè)線性范圍在0.024～2.76ng/mL之間，可以彌補(bǔ)恩諾沙星ELISA試劑盒的不足，并豐富恩諾沙星殘留檢測(cè)的產(chǎn)品線［8］。

表7 HPLC、ELISA和CLEIA靈敏度對(duì)比表Table 7 The sensitivity comparison table between HPLC，ELISA and CLEIA

圖4 ENR的HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of HPLC for ENR

圖5 HPLC和CLEIA相關(guān)性曲線圖(n=5)Fig.5 Correlation between HPLC and CLEIA(n=5)

3 結(jié)論

本文研制了恩諾沙星的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，該試劑盒的IC50為0.106ng/mL，線性范圍在0.024～2.76ng/mL之間;應(yīng)用于各樣品的添加回收率均落在80%～120%之間，批內(nèi)變異和批間變異均小于15%;與結(jié)構(gòu)類似物和功能類似物的交叉反應(yīng)率都小于1.43%;在4℃環(huán)境中，能保存180d以上;與HPLC方法進(jìn)行對(duì)比，其線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9961。目前關(guān)于恩諾沙星的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒的研制在國(guó)內(nèi)報(bào)道很少，本文研制的試劑盒的靈敏度和特異性不僅能夠滿足目前檢測(cè)的需求，同時(shí)能夠滿足趨于嚴(yán)格的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，為恩諾沙星殘留限量新標(biāo)準(zhǔn)制定提供參考［19－20］。

［1］趙亞凝.氟喹諾酮類藥物的不良反應(yīng)［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，9(4):295－297.

［2］林居純，曾振靈.氟喹諾酮類藥物耐藥性產(chǎn)生的分子機(jī)制［J］.中國(guó)獸藥雜志，2005，39(9):41－45.

［3］BROWN S A.Fluoroquinolones in animal health［J］.J Vet Pharmacol Ther，1996，19(1):1－14.

［4］HERNANDEZ－ARTESEROS J A，BARBOSA J，COMPANO R，et al.Analysis of quinolone residues in edible animal products［J］.Journal of Chromatography A，2002，945(2):1－24.

［5］林維宣.各國(guó)食品中農(nóng)獸藥殘留限量規(guī)定［M］.大連:大連海事大學(xué)出版社，2002:1291－1381.

［6］彭濤，雍煒，安娟，等.反相高效液相色譜/質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定雞肉中5種喹諾酮藥物殘留［J］.分析化學(xué)研究簡(jiǎn)報(bào)，2006，34:10－14.

［7］何云亞，陳曉紅.高效液相色譜熒光檢測(cè)法測(cè)定全血中環(huán)丙沙星和恩諾沙星的研究［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008(7):38－42.

［8］陳雪嵐，金晶，楊曉慧.恩諾沙星快速酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)試劑盒的研制［J］.食品科學(xué)，2010(8):16－19.

［9］趙莉莉，黃飚，王曉嵐.恩諾沙星時(shí)間分辨熒光免疫分析方法的建立［J］.食品科學(xué)，2011(10):110－114.

［10］肖勤，林金明.化學(xué)發(fā)光免疫分析新進(jìn)展［J］.分析實(shí)驗(yàn)室，2011(1):111－122.

［11］陳海斌.化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)及其進(jìn)展［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)裝備，2011(5):56－59.

［12］魏光偉，余永鵬，魏文康，等.化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)及其應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010(3):97－102.

［13］邱云青，李鳳琴.化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在食品有害因素檢測(cè)中的應(yīng)用［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)(衛(wèi)生學(xué)分冊(cè))，2009(6):371－374.

［14］宮敏之，計(jì)融，江濤，等.海豚毒素單抗ELISA試劑盒的研制［J］.中國(guó)公共衛(wèi)生，2005(12):1423－1424.

［15］劉春娥，林洪，曹立民，等.恩諾沙星酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法的建立及其與HPLC方法的比較研究［J］.中國(guó)動(dòng)物檢疫，2009，26(9):44－46.

［16］王保玲，袁利鵬，雷紅濤，等.沙丁胺醇直接競(jìng)爭(zhēng) ELISA法快速測(cè)定［J］.食品科學(xué)，2010(20):270－274.

［17］馮婷婷，劉一兵，李子穎，等.恩諾沙星單克隆抗體的制備及酶聯(lián)免疫分析方法的建立［J］.同位素，2009(1):145－149.

［18］趙銀麗，王建華，王自良，等.恩諾沙星單克隆抗體的制備及icELISA試劑盒的研制［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2009，37(2):33－40.

［19］Francisco Moragues，Carmen laualada.How to decrease ion suppression in a ltiresidue determination of β－agonists in animal liver and urine by liquid chromatography－mass spectrometry with ion－trap detector［J］.Analytica Chimica Acta，2009，637:193－195.

［20］Hu K，Huang X Y，Jiang Y S，et al.Monoclonal antibody based enzyme－linked immunosorbent assay for the specific detection of ciprofloxacin and enrofloxacin residues in fishery products［J］.Aquac Lture，2010，310:8－12.

Development of an indirect competitive chemiluminescence enzyme immunoassay kit for detecting of enrofloxacin residue

LIU Deng1，DING Fei2，HOU Rui－xia1，XU Zhen－lin1，SUN Yuan－ming1，YANG Jin－yi1，*
(1.Key Laboratory of Food Quality and Safety of Guangdong Provence，Collage of Food Science，
South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China;2.National Meat Products Quality Supervision and Inspection Center(Luohe)，Luohe 462000，China))

A HRP－Luminol－H2O2system based indirect competitive chemiluminescence enzyme immunoassay(CLEIA)kit for determination of enrofloxacin(ENR)residues was developed.The CLEIA conditions were optimized.The optimal concentration of coating antigen was 0.5ng/mL and the antibody dilution was 1∶2000.Using PBST as assay buffer，the incubation time for the primary antibody was 30min.Under the optimal conditions，the standard curve was developed.The regression equation for ENR was y=－22842x+172936 with a linear detection ranging from 0.024 to 2.76ng/mL.The IC50was 0.106ng/mL.The averaged recoveries of ENR from spiked honey，milk，shrimp and fish samples were 96%～116%，90%～97%，92%～112%and 86%～112%，respectively.The coefficient of variation of intra－assay and inter－assay was less than 15%.The developed kit can be stored at 4℃ for 180 days.

enrofloxacin;chemiluminescence enzyme immunoassay;kit

TS207.5

A

1002－0306(2012)17－0325－05

2012－03－06 *通訊聯(lián)系人

劉鄧(1986－)，男，碩士研究生，研究方向:食品質(zhì)量與安全。

廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目(2010A090200084，2011A090200029，2009B090300409)。