楊春霞，廖永紅，*，劉峻雄，胡建華，胡佳音，竇 屾

（1.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，食品添加劑與配料北京市高等學(xué)校工程中心，食品風(fēng)味化學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100048；

2.北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠，北京 101301)

牛欄山二鍋頭酒醅中芽孢桿菌分離鑒定及發(fā)酵風(fēng)味分析

楊春霞1，廖永紅1，*，劉峻雄1，胡建華2，胡佳音2，竇 屾1

（1.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，食品添加劑與配料北京市高等學(xué)校工程中心，食品風(fēng)味化學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100048；

2.北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠，北京 101301)

從牛欄山二鍋頭酒醅中分離篩選出5株產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)能力較好的芽孢桿菌，通過(guò)16S rDNA序列分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，5株細(xì)菌分別為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。分別對(duì)它們進(jìn)行發(fā)酵風(fēng)味分析，其發(fā)酵液經(jīng)固相微萃取和GCMS分析，并除去空白培養(yǎng)基中物質(zhì)，地衣芽孢桿菌BL-1發(fā)酵液共檢測(cè)得到14種風(fēng)味物質(zhì)，蠟樣芽孢桿菌BC-1和短小芽孢桿菌BP-1發(fā)酵都得到12種風(fēng)味物質(zhì)，枯草芽孢桿菌BS-1好氧發(fā)酵共得到16種風(fēng)味物質(zhì)，枯草芽孢桿菌BS-2厭氧發(fā)酵共得到19種風(fēng)味物質(zhì)。除短小芽孢桿菌外，其他4株芽孢桿菌都含有較多數(shù)量的酯類化合物，且主要代謝風(fēng)味物質(zhì)都是3-羥基-2-丁酮，而短小芽孢桿菌BP-1則含有數(shù)量較多的烴類化合物，其主要風(fēng)味物質(zhì)是苯乙醇。

風(fēng)味物質(zhì)，酒醅，固相微萃取，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，芽孢

白酒的釀造過(guò)程是棲息在酒醅中龐大微生物區(qū)系在酒醅固、氣、液三相界面復(fù)雜的物質(zhì)代謝過(guò)程。酒醅中微生物區(qū)系此消彼長(zhǎng)，各種物質(zhì)形態(tài)不斷產(chǎn)生和消失，通過(guò)復(fù)雜的物質(zhì)能量代謝變化，生成了多種香氣物質(zhì)[1]，進(jìn)而形成了白酒獨(dú)特的風(fēng)格特征和香型，微生物區(qū)系中具有產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)能力的菌株對(duì)白酒特征風(fēng)味的影響更大。近年來(lái)，隨著色譜技術(shù)的發(fā)展，相關(guān)人員對(duì)白酒中特征風(fēng)味物質(zhì)的研究已經(jīng)取得了一定的成果。利用氣相色譜-嗅聞法（GC-O）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）和全二維氣相色譜/飛行時(shí)間質(zhì)譜等色譜技術(shù)先后分析了茅臺(tái)、五糧液、汾酒等國(guó)內(nèi)多種名酒中的風(fēng)味物質(zhì)，還對(duì)某些特征風(fēng)味物質(zhì)做了定量分析[2-9]。白酒中各種香味成分的含量和相互之間的關(guān)系對(duì)白酒特征風(fēng)味的形成至關(guān)重要，但是目前對(duì)于白酒中一些關(guān)鍵的香味物質(zhì)的形成機(jī)制和酒醅中具有產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)能力的菌株發(fā)酵代謝機(jī)理的研究較少。早期曾有學(xué)者對(duì)茅臺(tái)酒曲、酒醅中的微生物進(jìn)行了分離鑒定，結(jié)果表明芽孢桿菌最多，同時(shí)還利用所分離的細(xì)菌制曲也生成了像茅臺(tái)大曲的香味。還有學(xué)者從醬香型曲中分離出嗜熱芽孢桿菌，并且研究得知該菌在醬香味物質(zhì)的生成過(guò)程中起著決定性的作用[10]。莊名揚(yáng)等從醬香型白酒大曲中分離鑒定出一株地衣芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)它能加速美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，其發(fā)酵液中也檢測(cè)出白酒中常見(jiàn)香味物質(zhì)[11]。張榮從郎酒高溫大曲中篩選鑒定得到三株地衣芽孢桿菌，并且對(duì)其發(fā)酵液采用GCMS分析，得到3-羥基-2-丁酮、四甲基吡嗪和呋喃扭爾是與醬香香氣有關(guān)的重要化合物[12]。趙佳等從汾酒酒醅中分離鑒定出28株產(chǎn)酸細(xì)菌，并對(duì)其中8株高產(chǎn)酸細(xì)菌進(jìn)行產(chǎn)酸分析研究，對(duì)調(diào)節(jié)汾酒釀造過(guò)程控制酒醅發(fā)酸提供了理論基礎(chǔ)[13]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)牛欄山二鍋頭酒醅中產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)的芽孢桿菌分離篩選，利用16S rDNA序列分析法分析鑒定芽孢桿菌，然后采用固相微萃取法對(duì)產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)的芽孢桿菌的發(fā)酵液進(jìn)行萃取，GC-MS分析檢測(cè)其發(fā)酵液中風(fēng)味物質(zhì)的組成。通過(guò)分析具有產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)能力芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物，探求各菌與酒中風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)系，進(jìn)而為研究各菌的代謝主要風(fēng)味物質(zhì)及其形成機(jī)理奠定基礎(chǔ)，為牛欄山二鍋頭酒中特征風(fēng)味的研究提供有效的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酒醅樣品 來(lái)源于北京牛欄山二鍋頭酒廠發(fā)酵地缸，分別于地缸醅料的表層、中層、下層3點(diǎn)混合均勻作為一個(gè)分析樣品，取樣時(shí)間發(fā)酵10d的酒醅，樣品密封后4℃保藏備用；異丙醇、十二烷基硫酸鈉、氯化鈉 均為分析純，北京化工廠；Loading Buffer、Taq DNA聚合酶、dNTPs混合液、蛋白酶K、RNaseA、D2000

天根生化科技（北京）有限公司；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂20g，去離子水1000mL；LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基 蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉10g，瓊脂20g，去離子水1000mL；玉米粉液體培養(yǎng)基 玉米粉60g，KH2PO43g，蔗糖10g，MgSO4·7H2O 1.5g，維生素B1100mg，去離子水1000mL。

6890N-5973i氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS） 美國(guó)Agilent；PC420固相微萃取儀、固相微萃取頭（CAR/ PDMS 75μm） 美國(guó)SUPELCO；YQX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱

上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；TC-XP-G PCR儀 杭州博日有限公司；Alphalmager紫外凝膠成像儀 美國(guó)安萊。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酒醅中芽孢桿菌的分離純化 采用梯度稀釋涂布法分離酒醅中芽孢桿菌，然后以好氧和厭氧兩種方式分別培養(yǎng)來(lái)篩選不同形態(tài)的芽孢桿菌。具體方法見(jiàn)圖1。

圖1 酒醅中細(xì)菌的分離純化Fig.1 Separation of bacteria from fermented grains

1.2.2 酒醅中產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)芽孢桿菌的篩選 將純化后的菌株以5%的接種量接種到玉米液體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h后用GC-MS檢測(cè)各菌株發(fā)酵液中風(fēng)味成分，以未接種的空白培養(yǎng)基作為對(duì)照，根據(jù)各菌株發(fā)酵液中風(fēng)味成分的數(shù)量篩選產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)芽孢桿菌。

1.2.3 固相微萃取條件 用CAR/PDMS 75μm萃取頭（Supelco）進(jìn)行萃取。在17mL頂空瓶中加入8mL發(fā)酵液和3g氯化鈉，插入萃取頭，60℃預(yù)熱5min，萃取吸附30min，GC解吸5min（250℃），用于GC-MS分析。

1.2.4 GC-MS分析條件 色譜條件：色譜柱為AB-1701毛細(xì)管柱（30m×0.25mm，i.d.×0.25μm）；升溫程序：45℃保持4min，以8℃/min的速度升溫至220℃，保持5min；載氣He流速1.0mL/min，進(jìn)樣量1μL，不分流進(jìn)樣。質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源；電子能量為70eV；離子源溫度為230℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 35～500。

1.2.5 酒醅中芽孢桿菌的16S rDNA序列分析

1.2.5.1 芽孢桿菌總DNA的提取 接種純化過(guò)的芽孢桿菌于LB液體培養(yǎng)基中，37℃，150r/min搖床培養(yǎng)15h；取2mL芽孢桿菌培養(yǎng)液，室溫下12000r/min離心5min，棄去上清液，收集菌體；菌體沉淀中加入567μL TE Buffer，反復(fù)吹打使之重新懸浮，加入30μL 10% SDS和10μL蛋白酶K，混勻后，37℃溫育1h；加入100μL 5mol/L氯化鈉，充分混勻，再加入80μL CTAB/NaCl，混勻后在65℃下溫育10min；加入等體積的飽和酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1，體積比），混合均勻，12000r/min離心10min；轉(zhuǎn)移上清液至1.5mL離心管中，加入0.6～0.8倍體積的異丙醇，輕輕混合均勻至DNA沉淀下來(lái)，12000r/min離心5min；棄去上清液，沉淀用1mL 70%乙醇洗滌，12000r/min離心10min，棄去乙醇；于潔凈的超凈臺(tái)上自然干燥后加15μL TE Buffer，放入-20℃冰箱保存。

1.2.5.2 16S rDNA PCR擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物檢測(cè) 將上述菌株基因組DNA作為PCR擴(kuò)增模板，采用100μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增：10×PCR緩沖液10μL，dNTPs（10mmol/L）8μL，上下游引物各4μL，Taq DNA聚合酶（2.5U/μL）1μL，超純水69μL，DNA模板4μL，最后以超純水為陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min。

PCR樣品檢測(cè)：在1%瓊脂糖凝膠上150V電泳30min，在EB中染色30min，漂洗后在紫外凝膠成像系統(tǒng)上拍照。

1.2.5.3 16S rDNA序列測(cè)定及分析 對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行16S rDNA測(cè)序。測(cè)序工作由北京三博遠(yuǎn)志公司完成，將測(cè)序結(jié)果輸入GenBank中，利用Blast功能組件將測(cè)得的基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的所有序列進(jìn)行同源性比較。

1.2.6 芽孢桿菌發(fā)酵液風(fēng)味物質(zhì)分析 將篩選鑒定完的具有產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)能力的芽孢桿菌以1%的接種量分別接種于玉米培養(yǎng)基中，以未接種的空白培養(yǎng)基為對(duì)照，37℃分別培養(yǎng)36h后，各發(fā)酵液進(jìn)行風(fēng)味物質(zhì)分析。

1.2.6.1 固相微萃取發(fā)酵液中風(fēng)味物質(zhì) 方法同1.2.3。

1.2.6.2 GC-MS分析條件 色譜條件：色譜柱為AB-1701毛細(xì)管柱（30m×0.25mm，i.d.×0.25μm）；升溫程序：35℃保持4min，以5℃/min的速度升溫至150℃，恒溫保持4min，然后以3℃/min的速度升溫至220℃，保持5min；載氣He流速1.0mL/min，進(jìn)樣量1μL，不分流進(jìn)樣。質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源；電子能量為70eV；離子源溫度為230℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 35～500。

2 結(jié)果與討論

2.1 酒醅中產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)芽孢桿菌的分離篩選

經(jīng)1.2.1中方法，好氧和厭氧兩種培養(yǎng)方式共分離得到48株芽孢桿菌。將48株芽孢桿菌分別按照1.2.2方法發(fā)酵培養(yǎng)，其發(fā)酵液經(jīng)GC-MS定性分析得知，大部分芽孢桿菌發(fā)酵液中風(fēng)味物質(zhì)種類很少，除去空白培養(yǎng)基中物質(zhì)，選定5株風(fēng)味物質(zhì)種類和含量較多的芽孢桿菌作為主要產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)芽孢桿菌，分別為BL-1、BC-1、BP-1、BS-1和BS-2。

2.2 芽孢桿菌的16S rDNA序列分析

用1%的瓊脂糖凝膠對(duì)5株產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)芽孢桿菌的16S rDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物做電泳檢測(cè)，通過(guò)凝膠成像分析系統(tǒng)觀察，其PCR擴(kuò)增的電泳圖如圖2所示。結(jié)果顯示在約1500bp處出現(xiàn)熒光條帶，且無(wú)明顯拖尾現(xiàn)象，陰性對(duì)照無(wú)條帶，說(shuō)明反應(yīng)體系沒(méi)有被污染。因此，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物能夠滿足后續(xù)測(cè)序的要求。

圖2 5株芽孢桿菌16S rDNA區(qū)域PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of five bacillus 16S rDNA

將測(cè)序得到的結(jié)果在GenBank上進(jìn)行16S rDNA序列同源性比較，調(diào)集高同源性典型菌株序列，用Blast，Clustal X和Mega3.0軟件分析，構(gòu)建出產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)芽孢桿菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖3。結(jié)合傳統(tǒng)分類方法與系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，BL-1與地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis F1）的同源性最近，BC-1與蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）的同源性最近，BP-1與短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus PLW-J4-4.1）的同源性最近，好氧菌株BS-1和厭氧菌株BS-2與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis RHH57）的同源性最近，同源性均能達(dá)到99%以上。

圖3 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of bacteria bases on the 16S rDNA sequence

2.3 芽孢桿菌發(fā)酵液風(fēng)味物質(zhì)分析

本實(shí)驗(yàn)按照1.2.6中方法，采用頂空固相微萃取法對(duì)5株芽孢桿菌發(fā)酵液和空白培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性萃取，然后用GC-MS對(duì)發(fā)酵液中風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，與空白培養(yǎng)基中的物質(zhì)比較，定性分析出5株芽孢桿菌的發(fā)酵代謝產(chǎn)物及其產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)的貢獻(xiàn)率。5株芽孢桿菌發(fā)酵液GC-MS總離子流色譜圖如圖4～圖9所示。由圖4～圖9可見(jiàn)，空白培養(yǎng)基經(jīng)GC-MS分析后共檢測(cè)得到14個(gè)峰，BL-1發(fā)酵液共檢測(cè)得到22個(gè)峰，BC-1發(fā)酵液共檢測(cè)得到16個(gè)峰，BP-1共檢測(cè)得到18個(gè)峰，好氧菌BS-1共檢測(cè)得到23個(gè)峰，厭氧菌BS-2共檢測(cè)得到28個(gè)峰。

圖4 空白培養(yǎng)基的總離子色譜圖Fig.4 GC-MS total ions chromatogram of blank medium

圖5 地衣芽孢桿菌BL-1發(fā)酵液中風(fēng)味物質(zhì)的總離子色譜圖Fig.5 GC-MS total ions chromatogram of flavor compounds in the fermentation of Bacillus licheniformis BL-1

圖6 蠟樣芽孢桿菌BC-1發(fā)酵液中風(fēng)味物質(zhì)的總離子色譜圖Fig.6 GC-MS total ions chromatogram of flavor compounds in the fermentation of Bacillus cereus BC-1

5株芽孢桿菌發(fā)酵液中風(fēng)味物質(zhì)主要有酯類化合物、烴類化合物、雜環(huán)類化合物、醇類化合物、醛酮類化合物和含氮化合物等，這些風(fēng)味物質(zhì)與白酒中的呈香化合物基本一致[14]。結(jié)合表1中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和圖10可知，5株芽孢桿菌發(fā)酵液剔除空白培養(yǎng)基中物質(zhì)共檢測(cè)得到46種風(fēng)味物質(zhì)，其中BL-1發(fā)酵液剔除空白培養(yǎng)基中物質(zhì)共得到14種風(fēng)味物質(zhì)，BC-1和BP-1發(fā)酵都得到12種風(fēng)味物質(zhì)，BS-1共得到16種風(fēng)味物質(zhì)，BS-2共得到19種風(fēng)味物質(zhì)。

圖7 短小芽孢桿菌BP-1發(fā)酵液中風(fēng)味物質(zhì)的總離子色譜圖Fig.7 GC-MS total ions chromatogram of flavor compounds in the fermentation of Bacillus pumilus BP-1

圖8 枯草芽孢桿菌BS-1發(fā)酵液中風(fēng)味物質(zhì)的總離子色譜圖Fig.8 GC-MS total ions chromatogram of flavor compounds in the fermentation of Bacillus subtilis BS-1

圖9 枯草芽孢桿菌BS-2發(fā)酵液中風(fēng)味物質(zhì)的總離子色譜圖Fig.9 GC-MS total ions chromatogram of flavor compounds in the fermentation of Bacillus subtilis BS-2

由圖10可見(jiàn)，5株芽孢桿菌發(fā)酵液中風(fēng)味物質(zhì)的數(shù)量相差不大，但是這5株芽孢桿菌各自發(fā)酵得到的化合物種類差異較大。地衣芽孢桿菌不產(chǎn)醚類和酸類化合物；蠟樣芽孢桿菌不產(chǎn)含氮化合物、醚類和酸類化合物；短小芽孢桿菌不產(chǎn)酸類物質(zhì)，與其它4株菌相比，短小芽孢桿菌發(fā)酵代謝能得到較多的烴類化合物，含有較少的酯類化合物；2株枯草芽孢桿菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物基本相同，不同之處在于好氧芽孢桿菌BS-1不產(chǎn)含氮化合物和醚類化合物，而厭氧枯草芽孢桿菌BS-2不產(chǎn)酸類化合物。此外，地衣芽孢桿菌發(fā)酵液中含有數(shù)量較多的酯類和含氮化合物，占總數(shù)的64%；蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵液中含有數(shù)量較多的酯類和醛酮類化合物，占總數(shù)的58%；短小芽孢桿菌發(fā)酵液中含有數(shù)量較多的烴類和醇類化合物，占總數(shù)的50%；枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中含有數(shù)量較多的酯類和雜環(huán)類化合物，占總數(shù)的50%左右。

表1 芽孢桿菌發(fā)酵液中風(fēng)味物質(zhì)GC-MS分析結(jié)果Table 1 GC-MS results of volatile compounds in the fermentation of bacteria

續(xù)表

圖10 5株芽孢桿菌發(fā)酵液中風(fēng)味物質(zhì)種類數(shù)量對(duì)比Fig.10 Compare the quantity and variety of volatile compoundsin the fermentation of Bacillus producing flavor

表1中數(shù)據(jù)顯示，BL-1發(fā)酵液中主要風(fēng)味物質(zhì)有3-羥基-2-丁酮、乙酸乙烯基酯和己酸乙酯；BC-1發(fā)酵液中主要風(fēng)味物質(zhì)有3-羥基-2-丁酮、6-甲基-1，3，5-環(huán)庚三烯和2-甲氧基-4-乙烯基苯酚；BP-1發(fā)酵液中主要風(fēng)味物質(zhì)有苯乙醇、2，4-二叔丁基-1，3戊二烯和十四烷；BS-1中發(fā)酵液中主要風(fēng)味物質(zhì)有3-羥基-2-丁酮、2，3-丁二酮和DL-丙氨酸乙酯，BS-2中發(fā)酵液中主要風(fēng)味物質(zhì)有3-羥基-2-丁酮、2，3-丁二酮和2，3-丁二醇。5株芽孢桿菌中除了短小芽孢桿菌BP-1不產(chǎn)3-羥基-2-丁酮，其他4株芽孢桿菌發(fā)酵液中都產(chǎn)生3-羥基-2-丁酮，且是主要的代謝風(fēng)味物質(zhì)，尤其是兩株枯草芽孢桿菌中3-羥基-2-丁酮，產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)的貢獻(xiàn)率可高達(dá)50%以上。據(jù)文獻(xiàn)記載，3-羥基-2-丁酮呈黃油味[15]，對(duì)白酒的特征風(fēng)味產(chǎn)生一定的影響[6]。張榮在研究產(chǎn)醬香功能細(xì)菌代謝產(chǎn)物時(shí)發(fā)現(xiàn)3-羥基-2-丁酮是該菌發(fā)酵液中主要特征性風(fēng)味化合物之一，推測(cè)是另外一個(gè)特征風(fēng)味化合物的前體物質(zhì)[12]。短小芽孢桿菌BP-1發(fā)酵液中主要風(fēng)味物質(zhì)苯乙醇呈玫瑰香和蜂蜜香的清雅香氣，口感綿甜清爽，在白酒風(fēng)味和口感上起著重要作用[16]。

3 結(jié)論

牛欄山二鍋頭酒醅中分離鑒定得到5株產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)能力較好的芽孢桿菌，分別為地衣芽孢桿菌BL-1、蠟樣芽孢桿菌BC-1、短小芽孢桿菌BP-1和兩株枯草芽孢桿菌BS-1和BS-2。對(duì)這5株芽孢桿菌分別進(jìn)行發(fā)酵風(fēng)味分析，其發(fā)酵液經(jīng)固相微萃取和GC-MS分析，共檢測(cè)得到46種風(fēng)味物質(zhì)，其中酯類化合物13種、烴類化合物10種、雜環(huán)類化合物6種、醇類化合物6種、醛酮類化合物5種、含氮化合物4種、醚類和酸類化合物各1種。除短小芽孢桿菌的主要代謝產(chǎn)物是苯乙醇外，其他4株芽孢桿菌的主要代謝風(fēng)味物質(zhì)都是3-羥基-2丁酮。而研究發(fā)現(xiàn)牛欄山二鍋頭酒中的主要呈香物質(zhì)是3-甲基-1-丁醇和2-羥基-丙酸乙酯，未檢測(cè)到3-羥基-2-丁酮，表明4株芽孢桿菌產(chǎn)生的3-羥基-2-丁酮與牛欄山二鍋頭酒的特征風(fēng)味沒(méi)有直接關(guān)系。由于牛欄山二鍋頭酒醅可培養(yǎng)細(xì)菌中芽孢桿菌占主要，所以可以推測(cè)3-羥基-2-丁酮可能作為酒體風(fēng)味物質(zhì)的前體物質(zhì)，與其他代謝產(chǎn)物共同作用參與酒的特征風(fēng)味物質(zhì)形成，這與有關(guān)文獻(xiàn)中得到的結(jié)論類似[12]。同時(shí)也說(shuō)明了：白酒釀造過(guò)程是多菌種混合發(fā)酵，各種菌的不同代謝產(chǎn)物相互制約、相互協(xié)調(diào)、相互作用才能形成酒的獨(dú)特風(fēng)味。而短小芽孢桿菌的主要代謝產(chǎn)物苯乙醇在牛欄山二鍋頭酒中的香氣成分檢出，具有玫瑰香和蜂蜜香，能夠賦予白酒清新爽口的感覺(jué)，因此短小芽孢桿菌對(duì)酒中苯乙醇的含量具有直接影響。

[1]曹云剛，胡永鋼，馬燕紅，等.汾酒酒醅發(fā)酵過(guò)程中香氣成分的變化規(guī)律[J].食品科學(xué)，2010，31（22）：367-371.

[2]Zhu Shukui，Lu Xin，Li Keliang，et al.Characterzation of flavor compounds in Chinese liquor Moutai by comprehensive twodimensional gas chromatographt/time-of-flight mass spectrometry [J].Analytica Chimica Acta，2007，597：340-348.

[3]沈怡方.白酒生產(chǎn)技術(shù)全書[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，1998：35-40.

[4]李大和.建國(guó)五十年來(lái)白酒生產(chǎn)技術(shù)的偉大成就[J].釀酒，1999（6）：19-31，

[5]范文來(lái)，徐巖.中國(guó)白酒風(fēng)味物質(zhì)研究的現(xiàn)狀與展望[J].釀酒，2007，34（4）：31-37.

[6]曾祖訓(xùn).白酒香味成分的色譜分析[J].釀酒，2006，33（2）：3-6.

[7]丁云連，范文來(lái)，徐巖，等.老白干香型白酒香氣成分分析[J].釀酒，2008，35（4）：109-113.

[8]季克良，郭坤亮，朱書奎，等.全二維氣相色譜/飛行時(shí)間質(zhì)譜用于白酒微量成分的分析[J].釀酒科技，2007，3（153）：100-102.

[9]余乾偉.傳統(tǒng)白酒釀造工藝[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2010：222

[10]武思齊.產(chǎn)醬香芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物及其研究[D].貴州：貴州大學(xué)，2009.

[11]莊名揚(yáng)，王仲文.醬香型高溫大曲中功能菌B3-1菌株的分離、選育及其分類學(xué)鑒定[J].釀酒，2003，30（5）：26-29.

[12]張榮.產(chǎn)醬香功能細(xì)菌的篩選及其特征風(fēng)味化合物的研究[D].無(wú)錫：江南大學(xué)，2009.

[13]趙佳，雷振河，呂利華，等.汾酒產(chǎn)酸細(xì)菌的分離鑒定及其產(chǎn)酸條件研究[J].食品與工業(yè)科技，2009，35：43-46.

[14]康明官.清香型白酒生產(chǎn)技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：307-315.

[15]吳波，張寒俊，佘珠花.白酒中痕量揮發(fā)性有機(jī)物的固相微萃取HS-SPME-GC-MS分析[J].中國(guó)釀造，2006（2）：69-73.

[16]柳軍，范文來(lái)，徐巖，等.應(yīng)用GC-O分析比較兼香型和濃香型白酒中的香氣化合物[J].釀酒，2008，35（3）：103-107.

Identification of Bacillusfrom Niulanshan Erguotou fermented grain and analysis of flavor compounds in the fermentation

YANG Chun-xia1，LIAO Yong-hong1，*，LIU Jun-xiong1，HU Jian-hua2，HU Jia-yin2，DOU Shen1
（1.School of Food and Chemical Engineering，Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients，Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China；
2.Niulanshan Distillery，Beijing Shunxin Agriculture Co.，Ltd.，Beijing 101301，China）

Five strains of bacillus which can produce flavor were screened from Niulanshan Erguotou fermented grain.Using the sequences analysis of 16S rDNA and phylogenetic tree construction，five strains were identified as Bacillus licheniformis，Bacillus cereus，Bacillus pumilus and Bacillus subtilis.The fermentation broth of five bacillus strains were analyzed by solid phase micro-extraction and chromatography-mass spectrometry. Removing the compounds of blank，a total of 14 flavor compounds in fermentation broth of Bacillus licheniformis BL-1，12 flavor compounds in fermentation broth of Bacillus cereus BC-1 and Bacillus pumilus BP-1，16 flavor compounds in fermentation broth of Bacillus subtilis BS-1，19 flavor compounds in fermentation broth of Bacillus subtilis BS-2.Except Bacillus pumilus，the fermentation of other four Bacillus strains mainly contained esters compound，and 3-hydroxy-2-butanone was the most important flavor compound.However，the fermentation of Bacillus pumilus BP-1 mainly comprised alkynes compound and phenylethyl alcohol was the main flavor compound.

flavor compounds；fermented grain；solid phase micro-extraction；gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）；spore

TS261.1

A

1002-0306（2012）09-0069-06

2011－08－01 *通訊聯(lián)系人

楊春霞（1986-），女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目課題（2011BAD23B01，2011BAC11B06）。