史劉輝，朱 松，婁在祥，王洪新，*

（1.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122；

2.江南大學食品學院，江蘇無錫 214122)

鱈魚皮活性膠原的提取及酶解動力學研究

史劉輝1，2，朱 松1，婁在祥2，王洪新2，*

（1.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122；

2.江南大學食品學院，江蘇無錫 214122)

采用低溫酸酶結合法提取鱈魚魚皮膠原，通過考察不同提取條件，優(yōu)化了鱈魚皮膠原的提取工藝，并對所提膠原進行特性分析。以經(jīng)典的米氏方程理論為基礎，研究胃蛋白酶酶促水解鱈魚皮制備膠原的酶解反應特性，通過鱈魚皮的酶解曲線，建立數(shù)學方程，表征膠原提取過程的水解動力學行為。結果表明：鱈魚皮膠原提取的最佳工藝條件為：胃蛋白酶添加量為1.0%，料液比為1∶40，處理時間為24h，酸介質為檸檬酸，其濃度為0.20mol/L。在此條件下膠原提取率達到48.67%。胃蛋白酶水解鱈魚皮制備膠原的動力學模型為：-rs=（2.9004E-3[S]）/（[S]+0.2156），其中米氏常數(shù)Km=0.2156。

鱈魚皮，膠原，胃蛋白酶，酶反應動力學

膠原是一種白色、不透明、無支鏈的纖維型蛋白質，主要存在于動物肌腱、韌帶、軟骨、皮膚及其他結締組織中[1]，是一種重要的結構蛋白。具有完整三股螺旋結構的膠原，有良好的生物活性及優(yōu)越的組織相容性，在美容、醫(yī)藥衛(wèi)生[2]、組織工程、材料[3]等高附加值領域顯現(xiàn)出良好的應用前景。我國鱈魚年加工量約為50萬t，主要集中在山東威海、青島等地區(qū)。由此產(chǎn)生大量的加工下腳料，其中魚皮約占總量的7% ～8%，僅有少量加工為飼料用于養(yǎng)殖業(yè)，大部分被廢棄，因此目前加工利用還處于初級階段。研究顯示魚皮中膠原含量豐富，約占蛋白質總量的60%～80%，是魚體各部位中含量最高的[4]，因此，鱈魚皮可以作為膠原提取的良好原料，從而提高水產(chǎn)加工的經(jīng)濟附加值[5]。鱈魚為海洋冷水魚，相比陸生動物，鱈魚皮膠原的熱穩(wěn)定性差，變性溫度較低，所以為保證膠原活性，選取在低溫下進行提取研究。低離子濃度酸可以破壞分子間鹽鍵和希夫氏堿，引起膠原纖維膨脹、溶解，但在水解過程中，只可使可溶性膠原溶解出來，所以在低溫下加入胃蛋白酶處理魚皮進行限制性降解，可以水解掉膠原纖維蛋白的末端肽，從而使主體部分溶于酸中被提取出來，提高膠原的產(chǎn)率，且不會破壞膠原的三股螺旋結構，保持其優(yōu)良的物理和生化特性[1]。同時，酸的加入適合于胃蛋白酶酸性范圍的最適pH。鱈魚皮研究大多集中于明膠、多肽提取研究等方面，有關鱈魚皮活性膠原的研究報道較少，本文采用酸酶結合法進行鱈魚皮活性膠原的提取條件優(yōu)化，并以酶解反應動力學的理論為依據(jù)，擬從底物濃度方面對提取體系進行研究，探討胃蛋白酶酶解鱈魚皮反應的動力學機制。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

鱈魚皮 山東威海；胃蛋白酶（比活力1∶10000）sigma公司；其他試劑 均為分析純。

90-1型恒溫磁力攪拌器 上海滬西分析儀器有限公司；Aglient-1100高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；FT-IR光譜儀 Thermo electron corporation；UV-1100型紫外可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司；CL20-B型冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；真空冷凍干燥機Alpha 1-4 LST 德國CHRIST公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設計

1.2.1.1 鱈魚皮膠原蛋白的酸酶結合提取工藝流程

鱈魚皮原料→預處理→酸酶解→離心過濾→滅酶→鹽析→離心→復溶→透析→冷凍干燥→膠原成品

1.2.1.2 鱈魚皮的預處理 脫脂：將鱈魚皮用正己烷4℃下浸泡8h，間歇攪拌。除雜：采用NaCl去除鱈魚皮中鹽溶性蛋白、蛋白多糖及其他雜質，向魚皮中加入7.5%的NaCl溶液，于4℃浸泡12h。

1.2.1.3 酸介質的選擇 選取不同酸性處理劑對鱈魚皮進行溶脹浸提。向魚皮中分別加入一定濃度的乙酸、鹽酸、乳酸、檸檬酸溶液，浸提一定時間，過濾，測定濾液中膠原蛋白含量，計算膠原溶出率，確定最佳酸介質。

1.2.1.4 鱈魚皮膠原提取單因素實驗 準確稱取1.0g凍干除雜魚皮，懸于檸檬酸溶液中，加入胃蛋白酶于4℃下進行酶解，酶解后在4℃下10000r/min離心20min，取上清液，測定膠原蛋白含量。在保證膠原結構完整的前提下，以膠原提取率作為響應指標，考察酸介質濃度、酶濃度、料液比、作用時間等因素對膠原提取效果的影響。

1.2.1.5 鱈魚皮膠原提取正交實驗 綜合單因素實驗結果，選取4個主要影響因素：酸介質濃度、酶濃度、料液比、作用時間，各取3水平，設計L9（3）4正交實驗，優(yōu)化最佳提取工藝條件。

表1 L9（34）因素水平表Table 1 L9（34）experimental factors and levels

1.2.2 檢測指標

1.2.2.1 膠原含量及提取率 采用高效液相色譜FMOC-CL柱前衍生化法檢測膠原特征氨基酸-羥脯氨酸含量，進行特征常數(shù)換算，得到膠原蛋白含量。膠原（%）＝羥脯氨酸%×11.1（11.1為換算常數(shù)）[6]

膠原的提取率（%）=提取液中膠原的含量/魚皮中膠原的含量×100%

1.2.2.2 鱈魚皮膠原的紅外光譜分析 將一定量干燥后的KBr和膠原凍干樣品置于瑪瑙研缽中，研磨均勻，成粉末狀，裝樣，壓片，取出樣品小心放入樣品室。采用傅立葉紅外光譜儀對樣品在4000～500cm-1波段進行掃描。

1.2.2.3 紫外光譜分析 將提取得到的一定量鱈魚皮膠原樣品溶解于0.5mol/L醋酸溶液中，配制成2g/L膠原溶液，以0.5mol/L的醋酸溶液作為對照。用UV-1100紫外分光光度計在200～400nm近紫外光區(qū)進行全波段掃描測定。

1.2.2.4 SDS-PAGE電泳 采用十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）方法分析膠原樣品，電泳條件如下：7.5%的分離膠、5%的濃縮膠；電泳緩沖液為Tris-甘氨酸緩沖液（pH8.3，含0.1%SDS）；樣品緩沖液為0.05mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH8.0，含2%SDS、5%β-巰基乙醇、10%甘油和0.02%溴酚蘭）；染色液為0.1%考馬斯亮藍R250-甲醇-冰醋酸（9∶9∶2，v/v/v）；脫色液為水-甲醇-冰醋酸（8∶1∶1，v/v/v）。

取冷凍干燥樣品1mg溶于0.5mol/L的醋酸溶液中，調節(jié)pH為中性，加入樣品緩沖液，沸水浴煮沸5min，8000r/min離心5min后取15μL上樣。采用直流穩(wěn)壓電源，電流為15mA，電泳2～3h。

1.2.3 酶解動力學分析 4℃條件下，以預處理過的凍干魚皮為底物，酶濃度為0.5%（w/v），稱取不同量（4、6、8、10、12g）的鱈魚皮浸于300mL，0.15mol/L（pH2.0）檸檬酸溶液中，制得不同底物濃度的懸浮液，測定不同反應時間（12、24、36、48h）后溶液中產(chǎn)物-膠原濃度。用Excel軟件通過Lineweaver-burk雙倒數(shù)法求解米氏常數(shù)，并推導出鱈魚皮膠原酶解動力學方程。

2 結果與分析

2.1 酸介質的選擇

膠原肽鏈的端基和側鏈均含有氨基，即存在著許多堿性基團，它們在溶液中能與酸結合。膠原肽鏈的堿性基團與酸結合后，膠原分子間及肽鏈間的離子交聯(lián)鍵和氫鍵將被打開，膠原就會吸水膨脹，進而發(fā)生酸溶，所以低離子濃度的酸溶液能使得魚皮組織纖維膨脹溶解。不同種類的酸，造成的膨脹率也有差別。分別采用0.3mol/L的4種酸溶液于4℃對鱈魚皮進行浸提，結果見圖1。

圖1 不同酸介質處理對膠原提取率的影響Fig.1 The effect of acid on productivity of collagen

對比可見，不同的酸造成膠原的膨脹率不同。以上4種酸類處理劑中檸檬酸對膠原纖維的溶脹效果最好，膠原提取率最高，可達到13.74%，是鹽酸的5.82倍，乳酸的1.24倍，乙酸的1.23倍，其中有機酸在鱈魚皮膠原提取中優(yōu)勢明顯。熱力學中的靜電排斥理論[1]認為，膠原在偏離等電點的酸性溶液或堿性溶液中使肽鏈側基帶同種電荷，這些同號電荷互相排斥，增大了膠原肽鏈間的距離而發(fā)生膨脹。檸檬酸分子較其他三者有3個H+可以電離，使得這種排斥作用較強，且無刺激性酸味，作為添加劑，世界糧農(nóng)組織（FAO）和世界衛(wèi)生組織（WHO）通告的每日允許食用量（ADI）也未對其加以限量使用，更適用于食品、藥品及化妝品等行業(yè)，所以選擇檸檬酸為鱈魚魚皮的最佳酸介質。

2.2 單因素提取工藝條件的確定

2.2.1 檸檬酸濃度對膠原提取率的影響 低離子濃度的酸溶液能促使魚皮組織纖維膨脹，使得單體膠原蛋白分子溶于酸溶液中。由于膠原蛋白在酸溶液中較穩(wěn)定，在酸性條件下溶解性最好，前面優(yōu)選出檸檬酸對鱈魚皮膠原溶出效果最佳，不同檸檬酸濃度下膠原蛋白的提取率不同如圖2所示。隨著檸檬酸溶液濃度不斷升高，膠原的提取率不斷增大，在濃度達到0.10mol/L之后，增幅趨緩；而在濃度為0.25mol/L時，略有下降，考慮到胃蛋白酶的最適pH范圍約為1.5～2.5，而檸檬酸濃度過高，會導致溶液pH過低，影響酶的活性，進而影響膠原提取率，故檸檬酸濃度應選擇0.10～0.20mol/L。

圖2 檸檬酸濃度對膠原提取率的影響Fig.2 The effect of citric acid concentration on the yield of collagen

2.2.2 胃蛋白酶濃度對膠原提取率的影響 胃蛋白酶的濃度也是影響膠原提取率的重要因素。如果酶濃度過低，則底物不能充分反應，而濃度過高則會引起酶分子之間的抑制作用，阻止酶解反應的進行，同時也會造成膠原酶解過度，形成小分子肽段。由圖3可見，膠原的提取率隨胃蛋白酶用量的增大而增大。酶用量較小時，膠原提取率隨酶用量的增大而增長較快，當酶用量大于1%時，膠原的提取率增長緩慢，這是因為當胃蛋白酶用量較少時，底物濃度相對而言較大，足以使酶飽和，此時，反應速度與酶濃度成正比，而當酶濃度增大，酶解反應的速度隨之增大，因而在單位時間內膠原的提取率增加較快；當酶用量增大到一定程度后，底物濃度不足以使酶飽和，同時由于產(chǎn)物與酶的可逆或不可逆結合、酶的接觸抑制作用等，再增大酶用量也不會使反應速度明顯加快。

2.2.3 料液比對膠原提取率的影響 魚皮在酸介質中浸泡溶脹，膠原纖維的溶脹情況越好，越有利于后續(xù)胃蛋白酶對魚皮膠原的酶解作用。由圖4中可見，料液比較小時，魚皮沒有得到較好的溶脹，膠原提取率很低；隨著料液比的增大，魚皮溶脹情況轉好，膠原提取率不斷升高，在料液比達到1∶30后，膠原基本達到充分溶脹，提取率增幅明顯趨緩，基本達到穩(wěn)定值。

圖3 酶濃度對膠原提取率的影響Fig.3 The effect of addition of pepsin on the yield of collagen

圖4 料液比對膠原提取率的影響Fig.4 The effect of solid/liquor ratio on the yield of collagen

2.2.4 酶解時間對膠原提取率的影響 由圖5可見，膠原提取率總體上隨著酶解時間的延長而升高，但升高的幅度逐漸減小。水解時間較短時，膠原提取率隨時間的增長而增大較快，當水解時間超過36h后，膠原的提取率增長緩慢，基本達到穩(wěn)定值。這可能是因為當提取時間較少時，膠原沒有完全溶脹，同時酶的作用也未充分發(fā)揮，因此，隨著時間的增加膠原的提取率也會增加，而當提取時間繼續(xù)增加時，膠原的提取率不會有明顯地增加，反而易因時間過長引起膠原的部分降解，故酶解時間選擇24～48h。

圖5 處理時間對膠原提取率的影響Fig.5 The effect of extraction time on the yield of collagen

2.3 正交實驗

在單因素實驗基礎上，考察不同的酸濃度、提取時間、料液比和酶濃度進行四因素三水平的正交實驗，結果及數(shù)據(jù)分析如表2、表3所示。依據(jù)上述極差和方差的分析結果可知，料液比對鱈魚皮膠原的提取率的影響極顯著，酶濃度、時間對鱈魚皮膠原提取率的影響顯著，酸介質濃度的影響不顯著。所選取的各因素條件對膠原提取率影響的主次順序是B>C>A>D，由正交實驗得出最佳酶解條件為B3C1A3D3，即酶濃度為1.0%，料液比為1∶40，處理時間為24h，酸介質濃度為0.20mol/L檸檬酸。根據(jù)篩選得到的最佳提取工藝，平行實驗3次，計算膠原的提取率，分別為48.7%、48.4%、48.9%，平均提取率為48.67%，依照最佳提取條件所得出的鱈魚皮膠原的提取率均大于正交設計中的提取率，表明此最佳提取工藝合理，且具有較好的穩(wěn)定性。

表2 正交實驗結果Table 2 Result of orthogonal experiment

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

2.4 鱈魚皮膠原的特性分析

2.4.1 紅外光譜 鱈魚皮膠原的FT-IR譜圖見圖6所示。N-H伸縮振動的吸收峰出現(xiàn)在3400～3440cm-1，但它以氫鍵形成締合體后，其峰將向低波數(shù)發(fā)生位移[7]。從圖中可以看出，膠原的酰胺A帶出現(xiàn)在3332cm-1，表明其N-H伸縮與氫鍵形成了締合體。鱈魚皮膠原酰胺Ⅰ帶的吸收在1655cm-1，符合酰胺Ⅰ帶的出峰位置。膠原酰胺Ⅱ帶的特征吸收頻率1546cm-1，符合膠原蛋白酰胺Ⅱ帶的吸收在1500～1600cm-1的范圍內。1200～1400cm-1譜帶歸屬于酰胺Ⅲ，是其他蛋白質所沒有的膠原紅外光譜特征吸收，是由C-N伸縮和N-H彎曲引起的[8]。鱈魚皮膠原蛋白的紅外圖譜顯示在1236cm-1（酰胺Ⅲ帶）和1451cm-1間有吸收帶存在，表明膠原蛋白的三股螺旋結構保持良好。

圖6 鱈魚皮膠原的傅里葉紅外光譜圖Fig.6 FT-IR spectrum of cod skin collagen

2.4.2 紫外光譜 通常蛋白質分子中含有一些能吸收紫外某一波長光的紫外生色基團，產(chǎn)生紫外吸收光譜[1]，如酪氨酸、苯丙氨酸的最大紫外吸收分別為283nm和251nm[9]。膠原只含少量芳香族氨基酸，在280nm處吸收較少，而膠原鏈所含的CO-，COOH，-NH都是生色基團，可以在230nm附近產(chǎn)生大的紫外光吸收，是蛋白質或肽的酰胺鍵的特征吸收峰。鱈魚皮膠原的紫外掃描光譜如圖7所示，可見其特征吸收波長位于230nm處。本研究所提取得到的膠原蛋白的紫外吸收光譜與已報道的膠原蛋白的紫外吸收特征一致[10]，因此可以初步推斷實驗提取的蛋白質為典型膠原蛋白。

圖7 鱈魚皮膠原蛋白的紫外光譜圖Fig.7 UV spectra of cod skin collagen

2.4.3 SDS-PAGE電泳 SDS-PAGE電泳結果如圖8所示，可見鱈魚皮膠原至少由兩條α鏈（α1和α2）組成，β鏈含量較高，并含有少量的γ鏈，這是典型的Ⅰ型膠原蛋白的特征。條帶α1可能含有α3成分[11]。亞基α1（α3）和α2的分子量分別為110ku、105ku，二者相差不大。

圖8 鱈魚皮膠原的SDS-PAGE電泳圖Fig.8 SDS-PAGE profile of cod skin collagen

2.5 酶反應動力學

2.5.1 酶促反應體系 鱈魚皮-胃蛋白酶酶促反應是一個復雜的非均相反應體系，屬于近似單底物酶促反應。

2.5.2 Michaelis-Menten方程的建立 米氏方程通用形式為：

在不同底物濃度、反應時間條件下，測定反應產(chǎn)物濃度，以時間t對產(chǎn)物濃度C作圖，得相關曲線函數(shù)，見圖9。

圖9 反應時間對產(chǎn)物濃度的影響Fig.9 The effect of reaction time on concentration of collagen

相關函數(shù)方程為：

表4 1/[S]與-1/rs的計算結果Table 4 Calculation of 1/[S]and-1/rs

代入式（1）中，則Michaelis-Menten方程為：

3 結論

3.1 本實驗以鱈魚皮為原料，采用低溫酸酶結合法提取膠原，考察酸介質種類、酸濃度、酶濃度、料液比、酶解時間因素對膠原提取率的影響，并通過正交實驗得出的最佳提取工藝為：酶濃度為1.0%，料液比為1∶40，處理時間為24h，酸介質濃度為0.20mol/L檸檬酸。在此條件下，鱈魚皮膠原提取率為48.67%。

3.2 本實驗制備的鱈魚皮膠原，通過傅里葉紅外光譜檢測顯示在1236cm-（1酰胺Ⅲ帶）和1451cm-1間有吸收帶存在，表明膠原的三股螺旋結構保持良好；紫外光譜掃描顯示膠原溶液在約230nm有一最大吸收峰，符合膠原的紫外吸收特征；SDS-PAGE電泳初步確定為I型膠原。

[1]蔣挺大.膠原與膠原蛋白[M].北京：化學工業(yè)出版社，2006.

[2]Swatschek D，Schatton W，Kellermann J，et al.Marine sponge collagen：isolation，characterization and effects on theskin parameters surface-pH，moisture and sebum[J].European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics，2002，53：107-113.

[3]馬福廣，李芳，彭燕豪，等.醫(yī)用膠原膠和膠原膜研制及臨床應用[J].中華創(chuàng)傷雜志，1995，11（3）：149-150.

[4]傅燕鳳，沈月新.淺談魚皮膠原蛋白的利用[J].食品研究與開發(fā)，2004，25（2）：16-18.

[5]苑艷輝.水產(chǎn)品下腳料綜合利用研究之進展[J].水產(chǎn)科技情報，2004，31（1）：44-48.

[6]日本食品工業(yè)學會食品分析法編輯委員會.食品分析方法（下）[M].重慶：四川科學技術出版社，1986.

[7]Muyonga J H，Cole C G，Duodu K G.Fourier transform infrared（FTIR）spectroscopic study of acid soluble collagen and gelatin from skins and bones of young and adult Nile perch（Lates niloticus）[J].Food Chemistry，2004，86：325-332.

[8]Prystupa D A，Donald A M.Infrared study of gelatin conformations in gel and sol states[J].Polymer Gels and Networks，1996（4）：87-110.

[9]Lin Y K，Liu D C.Comparison of physical-chemical properties of typeⅠcollagen from different species[J].Food Chemistry，2006，99：244-251.

[10]趙蒼碧，黃玉東，李艷輝.從牛腱中提取膠原蛋白的研究[J].哈爾濱工業(yè)大學學報，2004，36（4）：516-519.

[11]Kimura S，Takema Y，Kubota M.Octopus skin collagen isolation and characterization of collagen comprising two distinct α chains[J].The Journal of Biological Chemistry，1981，256（24）：13230-13234.

Study on extraction of cod skin collagen and reaction kinetics

SHI Liu-hui1，2，ZHU Song1，LOU Zai-xiang2，WANG Hong-xin2，*
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Wuxi 214122，China；
2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Collagen was isolated from cod skin by acid-enzyme binding method at 4℃.The extraction technology was optimized by exploring extraction parameters.The isolated protein was confirmed by different phsico-chemical techniques like FTIR，SDS-PAGE and so on.Based on the classic Michaelis-Menten equation theory，the hydrolytic characteristics of cod skin by pepsin were studied.Through the curves of the enzymatic hydrolysis experiments，the kinetics models were established to describe the process of hydrolysis.The results indicated that the optimal extraction conditions were as follows：pepsin addition of 1.0%，solid/liquor ratio of 1∶40，extraction time of 24h，citric acid concentration of 0.20mol/L.Under this condition，the yield of the cod skin collagen was 48.67%.The enzymatic dynamics equation：-rs=（2.9004E-3[S]）/（[S]+0.2156），where the Michaelis constant Km=0.2156.

cod skin；collagen；pepsin；kinetics characteristics

TS254.1

A

1002-0306（2012）09-0153-06

2011－07－29 *通訊聯(lián)系人

史劉輝（1986-），女，碩士研究生，研究方向：食品功能因子開發(fā)。