梅紅軍 劉洋 鄭先念 張覓 王河忠

脊髓損傷﹙SpinalCord Injury,SCI﹚的病理作用可分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。原發(fā)性損傷所造成的神經(jīng)損害是永久性的，功能無法恢復(fù)。繼發(fā)性損傷具有可逆性和可調(diào)控性，使脊髓損傷具有可恢復(fù)性[1]。近幾年報道認為細胞凋亡也是脊髓損傷機制中十分重要的因素之一[2]。目前有關(guān)藥物治療脊髓損傷的研究相當多[3]，但主要限于實驗階段，能夠用于臨床的藥物非常少，如甲基強的松龍等?，F(xiàn)在有關(guān)白藜蘆醇在脊髓損傷中的作用已有報道，但是研究仍然不夠完善。

本實驗組通過口服方法研究白藜蘆醇在脊髓損傷后脊髓組織氧化和抗氧化過程的作用，探討白藜蘆醇對脊髓損傷后神經(jīng)細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

髓過氧化物酶﹙MPO﹚檢測試劑盒和超氧化物歧化酶﹙SOD﹚檢測試劑盒由南京某生物公司提供。白藜蘆醇購自南京某醫(yī)藥有限公司，純度98%以上；MPSS由浙江某藥股份有限公司生產(chǎn)。在武漢大學人民醫(yī)院實驗中心選用SPF級雄性SD大鼠96只，體重250±50g。

1.2 實驗方法

本實驗采取隨機區(qū)組設(shè)計，實驗樣本隨機分為 4大組，即假手術(shù)組、損傷組、RES組、MPSS﹙陽性對照﹚組；每組24只，每組據(jù)損傷后處死時間﹙8小時、1天、3天、7天﹚隨機分為4個小組，每個小組6只。據(jù)Allen’s法人工造成中度脊髓損傷模型，藥物組術(shù)后立即按100mg/kg管飼MPSS或白藜蘆醇。取出以T8為中心新鮮脊髓組織，制成10%脊髓組織勻漿液，提取上清液，-20℃冰柜保存，以備酶活性檢測。

1.3 結(jié)果測定

將各組脊髓組織勻漿液上清夜利用試劑盒進行檢測，以比色法測定脊髓神經(jīng)組織細胞MPO和SOD活性，以表示。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用 SPSS 11.5版統(tǒng)計軟件進行單向方差分析﹙One way-Anova，先進行方差齊性檢驗，再進行方差分析，然后采用S-N-K法進行樣本均數(shù)間的多重比較﹚，有統(tǒng)計學差異的位于不同列，沒有統(tǒng)計學差異的位于同一列。

2 結(jié)果

2.1 髓過氧化物酶﹙MPO﹚活性

由表1可見脊髓損傷后MPO活性明顯升高，3天達到高峰，其后逐漸減弱，7天活性明顯減弱，白藜蘆醇組及MPSS組均能降低各時間點的MPO活性，抑制MPO升高幅度，差異具有極度顯著性統(tǒng)計學意義﹙＜ 0.01﹚；脊髓損傷后8小時白藜蘆醇組與 MPSS組具有極度顯著性統(tǒng)計學差異性﹙＜0.01﹚，脊髓損傷后1天白藜蘆醇組與MPSS組具有顯著性統(tǒng)計學差異性﹙＜ 0.05﹚，但是3天及7天兩者并無顯著差異性﹙＞0.05﹚，這顯示白藜蘆醇組的療效存在優(yōu)于MPSS組的趨勢。

表1 髓過氧化物酶﹙MPO﹚活性﹙,n=6,U/mg prot﹚

表1 髓過氧化物酶﹙MPO﹚活性﹙,n=6,U/mg prot﹚

與假手術(shù)組比較a＜0.01；與損傷組比較，b＜ 0.01；c＜0.05；與RES組比較d＜ 0.01；e＜0.05。

表2 超氧化物歧化酶﹙SOD﹚活性﹙,n=6,U/ml· mg﹚

表2 超氧化物歧化酶﹙SOD﹚活性﹙,n=6,U/ml· mg﹚

與假手術(shù)組比較，a：P ＜ 0.05；與損傷組比較，b：P ＜ 0.05；c：P ＜ 0.01；與 RES 組比較，d：P ＜ 0.05。

由表2可見在脊髓損傷后8小時、1天、3天及7天白藜蘆醇組及MPSS組與損傷組間差異均有顯著意義，但脊髓損傷后8小時、3天及7天白藜蘆醇組與MPSS組間差異無顯著性意義﹙>0.05﹚，這表明脊髓損傷后8小時、1天、3天及7天白藜蘆醇與MPSS均可以提高損傷脊髓的SOD活性，8小時、3天及7天兩者的作用效果具有相似性，但是在損傷后1天兩者顯示出明顯差異性，而且損傷后8小時、3天及7天白藜蘆醇組的作用效果要強于甲基強的松龍組，這表明白藜蘆醇與MPSS的作用機制存在一定的差異性。

3 討論

白藜蘆醇是從天然植物中分離出的活性單體，有一系列的衍生物，廣泛存在于葡萄屬種子植物之中[4]。1940年 Takaoka從毛葉藜蘆中分離出白藜蘆醇，化學名為3，5，4’-三羥基苯二烯，屬多酚類化合物。白藜蘆醇的生物學作用主要包括：拮抗腫瘤作用、抗炎作用、心血管保護作用、植物雌激素作用和影響骨鈣代謝等，而且具有神經(jīng)保護作用[5]。

白藜蘆醇口服后在腸道以葡萄糖醛酸酯形式易于吸收，半吸收時間為0.46小時，人口服白藜蘆醇1.5mg/kg,30分鐘血中達高峰，120分鐘恢復(fù)；大鼠口服60分鐘達高峰，240分鐘消失[3]。

脊髓繼發(fā)性損傷的病理生理機制非常復(fù)雜，許多學者提出了各種各樣的假說。李俊麗[6]總結(jié)有關(guān)理論主要有：①創(chuàng)傷后缺血性損傷；②炎癥損傷；③鈣內(nèi)流超載損傷；④自由基損傷；⑤興奮性氨基酸繼發(fā)損傷；⑥凋亡等。在不同致傷條件下，神經(jīng)細胞凋亡的時間和空間變化會有所不同，但都涉及到多種調(diào)控因子的改變。顯然，上述各種理論都只從一個側(cè)面描述脊髓繼發(fā)性損害的機制，但實際上它們構(gòu)成了一個相互聯(lián)系的有機整體，共同介導(dǎo)了脊髓繼發(fā)性損害的病理過程。在這個過程中，氧化及抗氧化作用的平衡失調(diào)具有重要的作用。

SOD是機體內(nèi)重要的抗氧化酶，是人體內(nèi)源性自由基清除系統(tǒng)的重要組成成分，它的I、II、III 3個大亞基由線粒體基因編碼并定位合成，具有酶催化活性。SOD活性水平高低反映了機體內(nèi)自由基代謝情況，在機體內(nèi)發(fā)揮著不可替代的作用。缺血再灌注時線粒體內(nèi)產(chǎn)生大量強活性的超氧陰離子自由基，經(jīng) SOD作用被歧化成H2O2，后者在過氧化氫酶作用下最終被還原為H2O，從而減輕自由基的損害作用；若SOD活性水平低下，超氧陰離子自由基能夠通過Haber-Weiss反應(yīng)，產(chǎn)生毒性更強的羥自由基[7]。

中性粒細胞是是急性炎癥反應(yīng)的主要細胞，也是第一個達到損傷部位的炎癥細胞[8]；MPO是中性粒細胞的特征性酶，存在于嗜中性粒細胞的嗜天青顆粒中，其活性高低反應(yīng)了中性粒細胞侵潤的程度及活性[9]。

本實驗發(fā)現(xiàn)，在脊髓損傷早期，無論是在損傷后 8小時、1天、3天及7天白藜蘆醇及甲基強的松龍都能夠明顯降低各時間點的MPO活性，提高脊髓組織SOD活性，而且損傷后1天兩者作用具有顯著性差異﹙＜ 0.05﹚，8小時則表現(xiàn)出效果上差異性，但是損傷3天及7天兩者并無差異顯著性﹙>0.05﹚，這說明白藜蘆醇對MPO及SOD的有效作用時間并不完全相同，并且存在一定程度的差異性。

綜上所述，白藜蘆醇在脊髓損傷后8小時、1天、3天及 7天能夠明顯提高脊髓組織中 SOD活性，并抑制MPO的活性升高幅度，與傳統(tǒng)藥物MPSS的作用效果相似，而且表現(xiàn)出了一定的優(yōu)異性，這表明兩者作用機制可能存在一定的差異。我們推測兩者在神經(jīng)細胞凋亡過程中的作用點可能不同。我們還需要進一步探討白藜蘆醇在脊髓損傷方面的作用機制，并對其提取和入藥作進一步研究。

白藜蘆醇具有多種有益的生物學效應(yīng)和較高的使用安全性，可以通過調(diào)節(jié)脊髓組織的氧化和抗氧化系統(tǒng)的平衡，能夠?qū)顾钃p傷后的神經(jīng)細胞起到保護作用，但是其作用機制的研究有待進一步完善。

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