孫 震，馮才偉，李 勇，吳 鵬，馮 靜，韓京朋

（北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京102206）

嘔吐毒素（vomitoxin），又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），化學(xué)名稱為3α，7α，1，5－三羥基草鐮孢菌－9－烯－8－酮，屬單端孢霉烯族化合物［1－2］。單端孢霉烯族毒素共有150多種，是一類強(qiáng)有力免疫抑制劑，所引起典型癥狀是采食量降低，所以這類毒素又叫飼料拒食毒素，DON是其中最重要一種毒素［3－4］。

DON主要來自鐮刀菌屬（Fusarium），尤其是禾谷鐮刀菌（Fusarium grarninearum）和黃色鐮刀菌（Fusarium culmorum），其結(jié)構(gòu)為四環(huán)倍半萜，分子式為 C15H20O6，分子質(zhì)量296.3 ku［5－6］。其結(jié)構(gòu)式如下（圖1）：

圖1 DON化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 DON chemical structure

由于DON具有很高的細(xì)胞毒性及免疫抑制性，因此，對人類及動(dòng)物的健康構(gòu)成了威脅。1998年，在國際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的評價(jià)報(bào)告中，嘔吐毒素被列為3類致癌物［7］。國際上對嘔吐毒素的檢測方法研究進(jìn)展較快。先后出現(xiàn)了薄層色譜法和高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）、酶聯(lián)免疫（ELISA）的檢測方法［8］。目前國內(nèi)用于DON檢測的ELISA試劑盒很少，而實(shí)現(xiàn)商品化的更少。本研究期望通過研究制備出抗DON的高效價(jià)、高特異性單克隆抗體，并最終開發(fā)出可用于食品中DON檢測的酶聯(lián)免疫檢測產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 DON為上海安普科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品，牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）為Sigma公司產(chǎn)品；3，3′，5，5′－四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、戊二醛、馬來酸酐、4－二甲氨基吡啶（DMAP）1－乙基－（3－二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、二甲基甲酰胺（DMF）為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗為美國Jackson公司產(chǎn)品；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑為北京勤邦生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI－1640為Hyclone公司產(chǎn)品，其他有關(guān)化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.2 儀器 Uitrospec紫外－可見光分光光度計(jì)為Amersham公司產(chǎn)品，磁力攪拌器90－2為上海振榮科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；低速離心機(jī)Anke TDL－40B為上海安亭科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀MK3為美國Thermo公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)及分析軟件為Syngene公司產(chǎn)品；JM－250電泳儀為大連捷麥科貿(mào)公司產(chǎn)品；生化培養(yǎng)箱DHP－600為天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司產(chǎn)品；電子天平、微量移液器等。

1.2 方法

1.2.1 半抗原合成 取20 mg DON、1 mol馬來酸酐、催化量的DMAP，溶于2 mL甲苯中，于80℃攪拌反應(yīng)，8 h～20 h后，蒸干溶劑，酸化，萃取，重結(jié)晶后得到DON半抗原，其合成公式見圖2。

圖2 半抗原合成路線Fig.2 DON hapten synthetic route

1.2.2 DON抗原合成 將DON半抗原與BSA偶聯(lián)得到免疫原。具體操作如下：取60 mg BSA溶于9.5 mL 0.01 mol／L，p H5.0的 PBS溶液中，加入12.5 mg EDC，再加入1 mL DMF 溶解的10 mg DON半抗原，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1 h，再加6 mg EDC，置于陰暗處攪拌反應(yīng)并過夜，用0.01 mol／L PBS透析3 d，每天更換透析液3次，得到DON－BSA，即為免疫原。將DON半抗原與OVA偶聯(lián)得到包被原。反應(yīng)步驟同免疫原制備，所用OVA量為45 mg。

1.2.3 偶聯(lián)抗原的鑒定

1.2.3.1 紫外分光光度計(jì)鑒定 將偶聯(lián)抗原進(jìn)行20倍稀釋后，分別在波長260 nm、280 nm處測定紫外吸光度，根據(jù)公式（1）計(jì)算結(jié)合抗原蛋白質(zhì)濃度［9］。

利用紫外－可見光分光光度計(jì)對DON、載體蛋白、偶聯(lián)抗原進(jìn)行掃描，在最大吸收波長λmax下測定其吸光值，根據(jù)公式（2）分別計(jì)算DON、載體蛋白、偶聯(lián)抗原的摩爾吸光系數(shù)。

式中：A是各物質(zhì)在最大波長處的吸光度，C是各物質(zhì)的濃度，L是比色杯的直徑。根據(jù)計(jì)算所得摩爾吸光系數(shù)（ε），按公式（3）計(jì)算偶聯(lián)抗原的結(jié)合比。

1.2.3.2 SDS－PAGE對偶聯(lián)抗原純度鑒定 將BSA、OVA 和偶聯(lián)產(chǎn)物DON－BSA、DON－OVA 用PBS（0.01 mol／L、p H7.4）適當(dāng)稀釋后，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。濃縮膠為50 g／L，分離膠為120 g／L，濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為160 V，上樣量為10μL，考馬斯亮藍(lán)染色5 h～6 h后，置脫色液中脫色過夜。

1.2.4 Mc Ab制備

1.2.4.1 動(dòng)物免疫 將合成的免疫原 DON－BSA與弗氏佐劑按1∶1的比例混合乳化，對6周齡～8周齡Balb／c小鼠進(jìn)行免疫，頸背部皮下多點(diǎn)注射，免疫劑量為150μg／只，分別在14 d和28 d進(jìn)行二免和三免，采用弗氏不完全佐劑，免疫劑量同上，31 d后加強(qiáng)免疫，直接采用免疫原免疫，免疫劑量為100μg／只，最后1次免疫后7 d斷尾采血分離血清，3 000 r／min離心5 min，收集血清備用。

1.2.4.2 融合細(xì)胞備用小鼠選擇 先用方陣滴定法確定檢測抗原最佳包被質(zhì)量濃度，然后用間接ELISA測定所采集的小鼠血清抗體效價(jià)，以待測孔OD450值≥NC OD450值的2.1倍（P／N≥2.1）判為陽性，選取效價(jià)高的小鼠作為脾細(xì)胞提供鼠，具體方法同鄧舜洲的方法［10］。

1.2.4.3 細(xì)胞的融合、篩選、克隆化及腹水制備 細(xì)胞融合前3 d，對融合小鼠采用DON－BSA 50μg／只（不含弗氏佐劑）腹腔注射式超免。取小鼠脾細(xì)胞與Sp2／0細(xì)胞進(jìn)行融合，用間接ELISA法進(jìn)行篩選，所用的包被抗原是5μg／mL OVA－DON檢測抗原，分別加入被測孔的培養(yǎng)上清，以P／N＞2.1為判斷依據(jù)，篩選陽性孔，選擇強(qiáng)陽性、抑制率高、細(xì)胞生長旺盛的孔采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，亞克隆化3次后所有孔的克隆都為陽性，最終得到分泌DON－McAb的雜交瘤細(xì)胞株，最后選擇OD值高、細(xì)胞活力好的單克隆細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存、鑒定和建株。按常規(guī)法制備腹水。

1.2.5 間接競爭ELSIA建立標(biāo)準(zhǔn)曲線 取DONOVA 以0.01 mol／L p H7.4的PBS作1∶3 000稀釋，按照每孔100μL進(jìn)行包被，37℃溫育2 h，傾去包被液，用PBST洗滌2次，每孔中加入200μL封閉液，37℃溫育2 h，傾去孔內(nèi)液體，備用。向酶標(biāo)板微孔中加入質(zhì)量濃度分別為0、0.5、1.5、4.5、13.5、40.5μg／L的系列DON標(biāo)準(zhǔn)品50μL／孔，隨即加入0.01 mol／L p H7.4的PBS以1∶3 000稀釋羊抗鼠酶標(biāo)二抗50 μL／孔，再加入0.01 mol／L p H7.4 PBS以1∶36 000稀釋的 DON－McAb 50μL／孔，25℃反應(yīng)30 min，用PBST洗滌3次，拍干，加入顯色底物，25℃反應(yīng)15 min，加入2 mol／L的硫酸終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀以450 nm／630 nm雙波長讀取OD值。

以酶聯(lián)免疫方法測定DON各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度值（B），以吸光度值（B）除以零標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值（B0）再乘以100%，得到百分吸光度值，以DON標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg／L）的對數(shù)值（log10C）為X軸（為方便數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用軟件分析時(shí)，通常將對數(shù)值用對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度值進(jìn)行替換），百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 Mc Ab鑒定

1.2.6.1 克隆抗體亞型鑒定 純化McAb用單克隆抗體Ig類／亞類鑒定試劑盒進(jìn)行抗體免疫球蛋白亞型鑒定。

1.2.6.2 McAb的分子質(zhì)量測定 腹水純化后，進(jìn)行SDS－PAGE。對電泳結(jié)果進(jìn)行凝膠成像分析，根據(jù)抗體重鏈和輕鏈在凝膠中遷移情況以及IgG中重鏈和輕鏈的比例關(guān)系，估算出抗體分子的分子質(zhì)量。

1.2.6.3 敏感性的測定 根據(jù)間接競爭ELISA方法所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算DON－Mc Ab對DON的IC50值。

1.2.6.4 交叉反應(yīng)率測定 選取2種其他霉菌毒素測定交叉反應(yīng)率，通過各毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別得到其IC50。按下式分別計(jì)算Mc Ab對其它霉菌毒素的交叉反應(yīng)率：

2 結(jié)果

2.1 偶聯(lián)產(chǎn)物的分析

2.1.1 偶聯(lián)抗原濃度的測定 偶聯(lián)抗原透析后，將透析袋中的液體定量。取出少量，經(jīng)稀釋后，分別在波長260 nm、280 nm處測定紫外吸光度，計(jì)算偶聯(lián)抗原的濃度。計(jì)算結(jié)果BSA－DON的濃度為5.6 mg／mL，OVA－DON的濃度為4.1 mg／mL。

2.1.2 紫外分光光度法計(jì)算偶聯(lián)抗原的分子結(jié)合比

用紫外分光光度計(jì)分別繪制DON、BSA、BSADON和DON、OVA、OVA－DON的紫外掃描圖（圖3、圖4）。偶聯(lián)抗原特征峰發(fā)生位移，表明偶聯(lián)成功。比色杯的直徑（L）相同，根據(jù)各物質(zhì)在最大波長處的吸光度（A）和各物質(zhì)的濃度（C），按照1.2.3.1所述公式計(jì)算得出偶聯(lián)抗原的分子結(jié)合比，BSA與DON的分子結(jié)合比為1∶18.4，OVA與DON的分子結(jié)合比為1∶12.8。

圖3 DON－BSA、BSA、DON紫外掃描圖譜Fig.3 UV spectra of DON－BSA，BSA and DON

圖4 DON－OVA、OVA、DON紫外掃描圖譜Fig.4 UV spectra of DON－OVA，OVA，and DON

2.1.3 SDS－PAGE 對偶聯(lián)抗原分析 將 BSA、OVA分別與制備的偶聯(lián)產(chǎn)物BSA－DON、OVADON進(jìn)行凝膠電泳分析，從電泳圖（圖5）中可以看出，因DON分子質(zhì)量很小，偶聯(lián)前后對載體蛋白分子質(zhì)量改變程度不大，所以偶聯(lián)前后蛋白質(zhì)的條帶位置變化較小。條帶的位置變化，初步證明了偶聯(lián)是成功的。

2.2 Mc Ab鑒定

2.2.1 Mc Ab工作濃度測定 采用方正滴定法確定最佳抗原包被質(zhì)量濃度與抗體工作濃度，結(jié)果見表1。對于酶標(biāo)儀，OD值在1～2之間時(shí)讀數(shù)的可信度較大，所以一般取OD值在1.5～2.0之間的孔所對應(yīng)的包被濃度為最佳包被濃度；另外為了后期免疫檢測產(chǎn)品的靈敏度和準(zhǔn)確度考慮，一般控制抑制率在70%～80%之間，從表1中可知，抗原包被質(zhì)量濃度為1.0μg／mL，Mc Ab工作濃度為1∶2.4×104時(shí)OD值和抑制率均符合要求。

2.2.2 Mc Ab亞型鑒定 用Ig亞類鑒定試劑盒（Ig－Gl、Ig G2a、IgG2b、Ig M、Ig A）經(jīng)間接 ELISA 方法檢測，結(jié)果表明所得Mc Ab均為IgGl。

2.2.3 腹水抗體分子質(zhì)量測定 對所得腹水Mc Ab純化后，進(jìn)行變性SDS－PAGE（圖6）。對電泳結(jié)果進(jìn)行凝膠成像分析，根據(jù)抗體重鏈和輕鏈在凝膠中遷移情況以及IgG中重鏈和輕鏈的比例關(guān)系，估算出了抗體分子的分子質(zhì)量為158 ku。

表1 抗原包被濃度和抗體稀釋濃度的測定結(jié)果Table1 Result of antigen coating and antibody dilution concentration

圖6 Mc Ab電泳圖譜Fig.6 SDS－PAGE spectrum of monoclonal antibody

2.2.4 敏感性鑒定結(jié)果 根據(jù)建立的間接競爭ELSIA方法得到的DON標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖7所示，標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線的線性回歸方程為y＝37.267x＋61.765，標(biāo)準(zhǔn)曲線IC50為1.7μg／L，該試驗(yàn)所獲Mc Ab對DON具有較高的敏感性。

2.2.5 Mc Ab特異性 交叉反應(yīng)率結(jié)果見表2。由表2可知，本試驗(yàn)制備的抗DON的Mc Ab與DON的交叉反應(yīng)率很高，而與T2、黃曲霉毒素B1幾乎沒有交叉反應(yīng)，故篩選到的單抗對DON具有很強(qiáng)的特異性。

圖7 DON標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Calibration curve of DON

表2 交叉反應(yīng)率檢測結(jié)果Table2 Results of cross－reactivity

3 討論

DON為小分子物質(zhì)（分子質(zhì)量296.3 u），沒有免疫原性，是不完全抗原，不能誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗體。必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后成為完全抗原才具有免疫原性可制備成免疫抗原［11－12］。而DON分子本身沒有可與載體蛋白結(jié)合的可供活化的功能基團(tuán)，因此無法直接制備DON偶聯(lián)抗原［15］。馬來酸酐分子中有兩個(gè)羰基C＝O和兩個(gè)雙鍵C＝C共軛，因而具有活潑的化學(xué)性質(zhì)，能進(jìn)行聚合反應(yīng)、異構(gòu)化、加成、自由基反應(yīng)、狄爾斯－阿爾德反應(yīng)、酯化反應(yīng)等［14］。因馬來酸酐分子中含有羧基，可與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合，因而可以形成蛋白質(zhì)與小分子的偶聯(lián)物。

本研究通過化學(xué)法合成羧基化的DON，分別與BSA、OVA偶聯(lián)作為免疫抗原和檢測抗原。因?yàn)锽SA與OVA之間沒有交叉抗原，所以可以用DON－BSA作為免疫抗原免疫小鼠，用DON－OVA包被酶標(biāo)板，檢測DON抗體的效價(jià)。

小鼠腹水中含有大量的內(nèi)含物，為消除這些內(nèi)含物的干擾，需對腹水進(jìn)行純化。腹水的純化應(yīng)根據(jù)單抗的種屬、免疫球蛋白的類型、抗體純度等選擇最佳的純化方法，同時(shí)還要考慮在純化的過程中保持抗體的活性、純度和得率等。本研究所得Mc Ab為IgG1亞型，所以可選用適用于IgGl抗體純化的辛酸－硫酸銨法對所得的腹水進(jìn)行純化［15］。

本研究所得Mc Ab分子質(zhì)量為158 ku，所制備的Mc Ab對DON具有很高的敏感性（IC50＝1.7 μg／L），并且抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.5μg／L～40.5μg／L之間線性關(guān)系良好，與T2、黃曲霉毒素B1幾乎沒有交叉反應(yīng)，完全能夠滿足對于DON殘留檢測要求，篩選到的Mc Ab可用于進(jìn)一步研制DON酶聯(lián)免疫檢測產(chǎn)品。

［1］侯海峰，陳龍明，韓紀(jì)舉，等.大骨節(jié)病病區(qū)糧食中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和硒元素檢測報(bào)告［J］.中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2010，44（7）：663－664.

［2］何成華，樊彥紅，劉國芳，等.一株脫氧雪腐鐮刀菌烯醇轉(zhuǎn)化菌的分離，鑒定及其轉(zhuǎn)化效果研究［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，32（4）：143－147.

［3］甄陽光，柏 凡，張克英，等.我國主要飼料原料及產(chǎn)品中吐毒素污染分布規(guī)律研究［J］.中國畜牧雜志，2009，45（8）：21－24.

［4］孫亞寧，侯玉澤，鄧瑞廣，等.真菌毒素性質(zhì)及免疫原制備方法的研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2010，31（11）：293－297.

［5］李鳳琴，于釧釧，邵 兵，等.2007—2008年中國谷物中隱蔽型脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及多組分真菌毒素污染狀況［J］.中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2011，45（1）：57－63.

［6］梁 穎，張春暉，劉鄰渭.液相色譜－質(zhì)譜測定小麥中B類單端孢霉烯族毒素［J］.中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2006，40（4）：293－295.

［7］申紅紅，楊美華，歐陽臻.鐮刀菌毒素DON和NIV研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（16）：8425－8428.

［8］何 敏，王一凡，鄧銜柏.脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 （DON）檢測方法研究進(jìn)展［J］.中國動(dòng)物檢疫，2008，25（4）：40－43.

［9］熊振宇，楊艷燕，李培武，等.兩種特異性氰戊菊酯人工抗原的合成與鑒定［J］.食品科學(xué)，2011，32（7）：178－182.

［10］鄧舜洲.DON無毒phage－ELISA檢測方法的建立及展青霉素免疫學(xué)檢測初探［D］.江西南昌：南昌大學(xué)，2005.

［11］金 萍.脫氧雪腐鐮刀菌烯醇抗原設(shè)計(jì)及直接競爭酶聯(lián)免疫方法［D］.江蘇無錫：江南大學(xué)，2011.

［12］Ghareeb K，Awad W.Ameliorative effect of a microbial feed additive on infectious bronchitis virus antibody titer and stress index in broiler chicks fed deoxynivalenol［J］.Poultry Sci，2012，91（4）：800－807.

［13］Meilin N.Comparasion of the IAC－HPLC and immunochromatographic assay method for the determination of vomitoxin［J］.J Anhui Agr Sci，2006，34（14）：3416－3449.

［14］崔希麗.馬來酸單酯的環(huán)氧化及雙酯化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)研究［D］.山東輕工業(yè)學(xué)院，2006.

［15］劉艷霞，譚建華.氟羅沙星單克隆抗體的制備及鑒定［J］.中國獸藥雜志，2010（10）：29－33.